大动脉粥样硬化型缺血性脑卒中患者外周血miR-29c和miR-370水平与颈动脉内中膜厚度的相关性

刘坦,赵星鹏,刘辉

(郑州大学附属洛阳中心医院 a.检验科;b.超声科 河南 洛阳 471009)

缺血性脑卒中是因缺血缺氧导致的脑组织病变坏死,进而引起神经功能缺损的一种疾病,其致死致残率极高,预后不良[1-2]。根据TOAST分型,缺血性脑卒中可分为大动脉粥样硬化型(large artery-atherosclerosis,LAA)、心源性栓塞型、小动脉闭塞型、其他原因型和原因不明型。其中,LAA型缺血性脑卒中较为常见,发病原因多为颈动脉粥样硬化所致[2]。目前,LAA型缺血性脑卒中的诊断主要依靠超声检查、血管造影及磁共振血管成像,而检测其发病及进展的实验室指标相对缺乏。在脑卒中miRNA表达谱的研究中发现,miRNA可能是诊断缺血性脑卒中的有效生物标志物,并且,研究证明脑损伤后血浆中miRNA表达会有明显变化,且在卒中进展过程中miRNA表达也发生暂时性变化[3-7]。颈动脉内中膜厚度(carotid intima-media thickness,IMT)是超声检查中最直观检测到的与动脉粥样硬化性病变相关的指标,被认为是早期动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)与脑卒中风险的亚临床标志物[8-10]。有数据证明miR-29c可以介导动脉粥样硬化氧化应激与炎症反应[11-14],miR-370通过靶向SIRT6、MPK1和调节Nrf2/ARE信号通路来加速脑缺血再灌注损伤的形成[15-16],但miR-29c及miR-370表达水平变化与LAA型缺血性脑卒中发生、进展之间的关系尚缺乏有力的数据支撑,且三者之间是否存在相关性及相互作用进而促进了LAA型缺血性脑卒中的发生发展仍有待进一步阐明。

基于此,本研究选取69例LAA型缺血性脑卒中患者和54例健康对照者,分析两组人群血浆miR-29c和miR-370表达水平的差异及与IMT值之间的相关性,同时结合已证实的与缺血性脑卒中密切相关的氧化应激和炎症指标,如缺血修饰白蛋白(ischemia modified albumin,IMA)、超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP),旨在探讨将其作为LAA型缺血性脑卒中生物标志物的应用价值,以期对LAA型缺血性脑卒中进行早期发现、干预和预防。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2020年10月至2022年3月在郑州大学附属洛阳中心医院进行就诊的经头颅CT或MRI诊断为LAA型缺血性脑卒中的69例患者作为观察组,其中男40例,女29例;年龄34～86岁,平均(64.90±12.67)岁;并选取同期在医院进行健康体检的54名体检者作为健康对照组,其中男27例,女27例,年龄41～72岁,平均(63.04±5.92)岁。两组在年龄和性别上差异无统计学意义(P>0.05)。该研究经医院医学伦理委员会审核批准。(1)纳入标准:①病史采集和体格检查符合第4届脑血管病学术会议修订的诊断标准,影像学检查CT或MRI发现梗死灶,支持LAA型缺血性脑卒中的诊断;②入院24 h内进行完善的实验室检查、相关资料完整;③进行颈部多普勒超声检查;④患者对本研究知情,签署知情同意书。(2)排除标准:①其他类型的缺血性脑卒中、出血性卒中、自身免疫性脑炎等脑血管疾病,其他原因导致的神经功能缺损、肿瘤或诊断不明确者;②临床资料、实验室资料或颈部超声资料不完整者。

1.2 样本收集

观察组和对照组均抽取空腹静脉血2 mL(EDTA-K2抗凝),3 000 r·min-1离心10 min分离血浆,置-70 ℃冰箱待用(观察组留取入院后治疗前第1次血样)。

1.3 方法与试剂

1.3.1miR-29c和miR-370表达水平检测

取出-70 ℃血浆室温复融后,使用血清/血浆miRNA提取分离试剂盒分离并提取外周血浆中的miRNA,按照miRcute增强型miRNAcDNA第一链合成试剂盒进行反转录合成 cDNA,使用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒进行荧光定量PCR检测,相关操作严格按照试剂盒说明书进行(所用试剂盒均来自天根生化科技有限公司)。选择U6为内参,正向引物为5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’,反向引物为5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’;miR-29c正向引物为5’-GTAGCACCATTTGAAATCAG-3’,反向引物为5’-TTGGCACTAGCACATT-3’;miR-370正向引物为5’-TAGCCTGCTGGGGTGGAA-3’,反向引物为5’-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3’。参照试剂说明书、经预实验后,设定反应条件为:95 ℃预变性15 min,94 ℃ 20 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 34 s共5个循环富集低丰度miRNA,94 ℃变性20 s、60 ℃退火延伸34 s,共40个循环。于61 ℃时采集荧光,用实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司生产,型号stepone plus)检测其表达量。通过2-△△ct方法计算miR-29c和miR-370的相对表达量(每个样本测定2次,取平均值)。

1.3.2IMT检查

采用飞利浦Q5彩色多普勒超声检查仪,探头频率4～12 MHz,由医院资深超声科医生(副主任医师及以上者)进行检查,严格按照中国血管超声操作规范进行,测量双侧颈总动脉IMT值,取平均值进行分析(每侧测量2次)。IMT≥1.0 mm定义为增厚[17]。

1.3.3IMA和hs-CRP检测

所用仪器为日立7600-110全自动生化分析仪,分别采用白蛋白-钴结合法和胶乳免疫比浊法,严格按照仪器及试剂说明进行操作。检测所用试剂均购自宁波瑞源生物科技有限公司(只对健康对照组进行检测,观察组从病例中调取相应结果)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 miR-29c和miR-370相对表达量及IMT值

观察组miR-29c的相对表达量低于健康对照组,miR-370的相对表达量高于健康对照组,IMT值高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组miR-29c、miR-370相对表达量和IMT值比较[M(P25,P75)]

2.2 miR-29c和miR-370相对表达量、氧化应激和炎症指标与IMT值间的相关性分析

通过Pearson相关性分析得到,随着颈总动脉IMT的增厚,外周血浆miR-29c相对表达量呈逐渐下降趋势,miR-370相对表达量呈逐渐上升趋势,miR-29c相对表达量与IMT呈低度负相关(r=-0.229,P<0.05),miR-370相对表达量与IMT呈中度正相关(r=0.492,P<0.05)。同时,IMT与IMA、IMT与hs-CRP及IMA与hs-CRP之间也存在正相关(r=0.459、0.260、0.322,P<0.05)。见表2。

表2 miR-29c和miR-370相对表达量、氧化应激和炎症指标与IMT值间的相关性分析(r)

2.3 miR-29c、miR-370和IMT值对LAA型缺血性脑卒中的诊断效能

分别对miR-29c、miR-370和IMT值进行ROC曲线分析得到:miR-29c、miR-370和IMT单独预测LAA型缺血性脑卒中发生的AUC分别为0.722、0.978、0.903,其中miR-370的预测价值最优,将3个指标联合检测分析,较其单独预测的灵敏度及特异度均有所增加,AUC达到最大。见表3、图1。

图1 ROC曲线分析miR-29c、miR-370和IMT对LAA型缺血性脑卒中的诊断效能

表3 miR-29c、miR-370和IMT预测LAA型缺血性脑卒中的ROC曲线结果

3 讨论

缺血性脑卒中作为全球重大公共卫生问题,是导致人类死亡和残疾的重要原因之一,对患者健康安全及生活质量造成严重影响[18],LAA型缺血性脑卒中为临床急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)最常见的类型,动脉粥样硬化是其发生发展过程中的重要一环[19],而IMT增厚和颈动脉斑块形成被认为是早期AS的亚临床标志物,与缺血性脑卒中的发生密切相关,并且可以预测AIS的发生[8-10]。及早诊断并进行病情程度评估对于临床治疗及预后具有重要意义[20-21],目前主要通过影像学检查对神经功能缺损进行有效评估,但对于短暂性脑缺血发作等也存在一定局限性,也尚未发现评估LAA型缺血性脑卒中的特异性血清生物标志物[22]。

以往研究已证明miR-29c通过调节编码细胞外基质蛋白(如A型胶原和3A型胶原)的miRNA靶点来调节动脉粥样硬化[23],也可以通过调节凝血因子纤维蛋白原等途径影响动脉粥样硬化斑块的形成,是早期发现动脉粥样硬化的潜在生物标志物[24]。也有研究报道,急性脑梗死患者脑脊液中miR-29c-3p表达异常下降[25];血清miR-33a、miR-29c、miR-126单项检测诊断脑动脉粥样硬化均具有较好的灵敏度和特异度[22]。这些都已证明miR-29c通过多种途径参与了LAA型缺血性脑卒中的发生过程,可以作为其潜在的生物标志物。本研究结果显示,miR-29c在LAA型缺血性脑卒中患者的相对表达水平低于健康人群,这与张玲等[25]的研究相一致。

miR-370在脂质代谢中起着关键作用,且在冠状动脉粥样硬化患者外周血中的水平较非冠脉硬化患者显著增加[26],miR-370的过度表达能够促进细胞的迁移与侵袭,从而参与了动脉粥样硬化的重要过程[27],并且Tian等[28]的研究表明miR-370能够抑制由氧化的低密度脂蛋白引发的血管炎症和氧化应激。以上研究都表明了miR-370可能通过多种途径参与LAA型缺血性脑卒中的发生。本研究结果也证实了外周血浆miR-370在发生LAA型缺血性脑卒中后,相对表达量显著增加,这也与上述结果相一致。

另外,对miR-29c和miR-370与IMT的相关性分析也发现,二者与IMT都存在关联,miR-29c相对表达量与IMT呈负相关,miR-370相对表达量与IMT呈正相关,同时,其他氧化应激及炎症相关指标IMA和hs-CRP与IMT之间也存在正相关,这些也从一定程度印证了他们之间可能存在一定协同作用,共同参与了LAA型缺血性脑卒中的发生。ROC曲线分析也显示,miR-29c、miR-370和IMT可以作为LAA型缺血性脑卒中发生的预测因子,单独预测时,以miR-370表现最优(灵敏度0.986、特异度0.926、AUC 0.978),三者联合检测时,诊断效能达到最大(AUC 0.995)。这也证实了外周血浆miR-29c、miR-370联合IMT检测更有助于提升LAA型缺血性脑卒中的临床诊断效能。

但是本研究也有一定不足,首先是样本数据量偏小,不可避免地会有数据偏差存在,需要多中心大数据的进一步验证。其次超声检查是由资深超声科医生完成的,但未固定人员,存在一定程度人员测量误差;颈总动脉IMT测量采用的是左、右颈总动脉分别测量后取平均值来计算,但若患者只有单侧颈总动脉IMT增厚,则也可能会导致平均IMT正常从而造成结果偏差。

4 结论

外周血浆miR-29c、miR-370水平及颈总动脉IMT值与LAA型缺血性脑卒的发生密切相关,三者联合检测对提高LAA型缺血性脑卒中的临床诊断效能具有重要意义。