液相色谱串联质谱法测定淡水虾中氯霉素残留的前处理优化研究

芦珊珊 黎川 杜美娜

摘 要：目的：分别建立液相色谱串联质谱法测定淡水红虾、青虾中氯霉素残留量的前处理方法。方法：分别采用3种前处理方法对淡水红虾、青虾进行氯霉素提取净化的优化试验，经液相色谱串联质谱法测定回收率及相对标准偏差。结果：采用方法c处理淡水红虾，回收率为90.7%～93.6%，相对标准偏差为6.7%～9.7%；采用方法a处理淡水青虾，回收率为90.2%～92.6%，相对标准偏差为5.0%～6.7%，均可满足实验室质量控制要求。结论：建立的适用于淡水红虾、青虾的两种前处理试验方法，操作简便，可以满足淡水红虾、青虾的氯霉素残留量的检测。

关键词：淡水虾；氯霉素；前处理；液相色谱串联质谱

Abstract： Objective： To establish a pre-treatment method for the determination of chloramphenicol residues in freshwater red shrimp and green shrimp by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： The extraction and purification of chloramphenicol from freshwater red shrimp and green shrimp were optimized by three pretreatment methods， and the recovery rate and relative standard deviation were determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Result： The recoveries of freshwater red shrimp were 90.7%～93.6% with relative standard deviation （RSD） of 6.7%～9.7% with method c in this paper， and the recoveries of freshwater green shrimp were 90.2%～92.6% with relative standard deviation of 5.0%～6.7% with method a in this paper， both of which could meet the requirements of laboratory quality control. Conclusion： The two pretreatment methods for fresh water red shrimp and green shrimp are easy to operate and can satisfy the determination of chloramphenicol residues in fresh water red shrimp and green shrimp.

Keywords： freshwater shrimp; chloramphenicol; pretreatment; liquid chromatography tandem mass spectrometry

在水產品养殖过程中，为了高效地防治疾病和加快水生动物的生长，会添加使用抗生素[1-2]。近年来，抗生素残留引发的一系列问题也越来越受到国内外研究学者的关注[3]。

氯霉素作为一种广谱类抗生素药物，因具有良好的抗菌效果而被水产养殖户广泛使用。因此，建立高效的氯霉素检测方法对水产品食品安全具有重要意义[4]。目前，已报道的氯霉素检测方法有液相色谱-串联质谱法[5-6]、气相色谱-串联质谱法[7]、液相色谱法[8-9]和酶联免疫法[10]等。有效的前处理是影响氯霉素残留量检测结果准确性的重要环节之一。本文采用3种不同的前处理方法对淡水虾进行试验，分别建立了适用于淡水红虾和青虾的快速、高效的氯霉素残留量检测的前处理方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

淡水虾（红虾、青虾）为本地农贸市场采购的活鲜。

氯霉素标准溶液（999.1 ?g·mL-1）、氯霉素-D5标准溶液（100.1 ?g·mL-1），购于北京曼哈格生物科技公司；乙腈、正己烷、甲醇和甲酸均为色谱纯，Fisher公司；无水硫酸钠和无水硫酸镁均为优级纯，国药集团化学试剂有限公司；C18固相萃取柱（500 mg/3 mL），深圳逗点生物技术有限公司。

液相色谱串联质谱仪（Waters Xevo TQD）；涡旋仪（IKA lab dance）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准工作溶液的配制

（1）氯霉素（9.991 ?g·mL-1）第一标准中间液配制。准确吸取氯霉素标准溶液（999.1 ?g·mL-1）100 ?L至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

（2）氯霉素（99.91 ng·mL-1）第二标准中间液配制。准确吸取氯霉素（9.991 ?g·mL-1）第一标准中间液100 ?L至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。现用现配。

（3）氯霉素-D5（20.02 ng·mL-1）内标工作溶液配制。准确吸取氯霉素-D5标准溶液（100.1 ?g·mL-1）100 ?L至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为1 001 ng·mL-1的氯霉素-D5内标溶液；准确吸取上述氯霉素-D5内标溶液（1 001 ng·mL-1）200 ?L至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为20.02 ng·mL-1的氯霉素-D5内标工作溶液。

（4）氯霉素系列标准工作溶液配制。分别准确吸取氯霉素（99.91 ng·mL-1）第二标准中间液5 ?L、10 ?L、20 ?L、50 ?L和100 ?L至1.0 mL容量瓶中，各加入氯霉素-D5（20.02 ng·mL-1）内标工作溶液250 ?L，用50%甲醇水溶液定容，得到系列浓度为0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1的氯霉素系列标准工作溶液，供液相色谱串联质谱法测定，现用现配。

1.2.2 仪器条件

（1）液相色谱条件。色谱柱：Waters C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；流速：0.2 mL·min-1；流动相甲醇-水（50∶50）。

（2）质谱条件。离子化模式：ESI，负离子模式；扫描模式：多反应监测模式；离子化电压：-4 500 V；离子源温度：550 ℃。

1.2.3 前处理优化方法

对已知阴性的生鲜淡水红虾和青虾，分别取可食用部分进行绞碎，并使其均质匀浆。

取淡水红虾、青虾匀浆样品，分别进行加标试验，氯霉素加标浓度均为0.10 ?g·kg-1、0.50 ?g·kg-1和1.00 ?g·kg-1这3个加标水平。分别按前处理方法a、b、c充分提取净化后进行仪器测定，每个样品重复测定6次，计算平均回收率和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD），考察精密度。

（1）方法a。称取5 g匀浆样品于50 mL离心管中，加入250 ?L氯霉素-D5内标工作液，加20 mL 1%乙腈、10 g无水硫酸钠，涡旋混合，经超声波提取，离心后取上清液，残渣重复提取1次，合并上清液，于40 ℃水浴旋转蒸发至干。加1.0 mL 50%甲醇溶液溶解残留物，再加2 mL正己烷，涡旋振荡后离心，上层液转移到离心管中，取下层清液过滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

（2）方法b。在方法a的基础上，加入2.0 mL 50%甲醇溶液溶解残留物和5 mL正己烷，萃取两次，涡旋混匀，离心，取下层清液置于离心管中，在进行液液分配时，加入少量乙醚，稀释有机相，使之比重减小，出现分層。合并两次萃取的下层清液，氮气吹干，用1.0 mL 50%甲醇溶解，经0.22 μm滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱仪测定。

（3）方法c。称取5 g匀浆样品于50 mL离心管中，加入250 ?L氯霉素-D5内标工作液、5 mL乙腈、5 mL 4%氯化钠溶液，涡旋振荡，离心后取上清液，残渣重复提取1次，合并上清液。再加5 mL正己烷，涡旋振荡后离心，上层液转移到离心管中，重复提取一次，合并提取液，氮气吹干，加入3 mL 5%乙腈使其溶解。过C18固相萃取柱，50%甲醇进行洗脱，收集洗脱液。然后加入经水饱和的乙酸乙酯溶液4 mL，涡旋振荡1 min，取上清液，重复操作一次，合并上清液，进行液液萃取，氮气吹干，再加入1.0 mL 50%甲醇溶解，经0.22 μm滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱仪测定。

2 结果与分析

方法a、b、c均采用具有高分离效能的钠盐析分层，实现待测物从水相到有机相的转移，方法a、b采取液液萃取的方式进行提取净化，方法b较a增加了液液萃取的净化步骤，方法c在a的基础上增加了固相萃取进行净化。

2.1 线性关系考察

将氯霉素系列标准工作溶液按1.2.2项下仪器条件方法进行测定，内标法定量，记录色谱图。以氯霉素系列标准工作溶液浓度为横坐标，以氯霉素峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，得到线性方程为y=2.288 71x+0.099 520 4，相关系数R2=0.999 239，表明该检测方法在0.5～10.0 ng·mL-1线性关系良好。

2.2 淡水红虾的前处理优化结果分析

由表1可知，淡水红虾采用方法a进行前处理，氯霉素的平均回收率为9.6%～16.4%，这是因为采用方法a进行前处理的过程中，即“加1.0 mL 50%甲醇溶液溶解残留物，再加2 mL正己烷，涡旋振荡后离心”，出现严重的乳化现象，采用室温过夜静置乳化层仍旧不能消除。乳化现象导致正己烷层与50%甲醇水溶液层无法完全分层，致使目标物提取不完全，从而导致回收率低。

采用方法b进行前处理，氯霉素的平均回收率为70.5%～72.5%，这是因为方法b增加了液液萃取步骤，同时在进行液液分配时，加入少量乙醚，稀释有机相，使之比重减小，容易分层，消除了乳化现象，使回收率有所提升。

采用方法c进行提取和固相萃取净化，结果显示红虾的回收率较方法a、b有明显提升，可以达到90.7%～93.6%。综上可知，方法b、c的样品回收率及RSD符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）附录F的要求，即加标量小于0.1 mg·kg-1时回收率为60%～120%，相对标准偏差小于15%的要求。方法a的回收率和RSD结果不符合实验室质量控制的标准要求。对比方法b、c可以看出，方法c的平均回收率更高，因此，淡水红虾选用方法c进行前处理提取净化。

2.3 淡水青虾的前处理优化结果分析

由表2可知，淡水青虾采用方法a进行前处理，回收率为90.2%～92.6%，RSD在5.0%～6.7%，符合GB/T 27404—2008附录F的要求。

采用方法b的氯霉素的回收率为91.2%～93.1%，RSD在4.6%～6.2%，较方法a变化不大，采用方法c的氯霉素的回收率为90.5%～92.1%，RSD在5.4%～6.3%，较方法a变化不明显。对比方法b和方法c，比较平均回收率和RSD，数据变化不大。因此，淡水青虾采用方法a进行前处理即可满足实验室质量控制要求。同时，方法a试验操作步骤少，较b和c在试验材料与试剂的使用上也更经济、更环保。

3 讨论

在对氯霉素残留的检测中，淡水红虾与淡水青虾在前处理的方法上有所不同，本文中淡水紅虾所采用的方法c，前处理过程首先经过4%氯化钠溶液盐析分层，去除蛋白，然后经过正己烷脱脂，再经乙酸乙酯提取，实现待测物从水相到有机相的转移，最后采用固相萃取，实现对待测物的净化。淡水青虾则使用方法a，即前处理首先经过4%氯化钠溶液盐析分层，去除蛋白，然后经过正己烷脱脂，再经乙酸乙酯提取，即可实现待测物从水相到有机相的转移及净化。笔者分析主要原因是淡水红虾脂肪、虾青素等大分子化合物含量较青虾更高，在进行前处理时，大分子化合物难以去除，因此淡水红虾与青虾的前处理方法不同。

4 结论

本方法通过对两种水产品（淡水红虾、淡水青虾）进行前处理优化研究，分别建立了适用于淡水红虾和青虾的氯霉素残留量快速检测的提取净化方法，操作简便，经液相色谱串联质谱法检测，内标法定量，采用方法c处理淡水红虾，回收率为90.7%～93.6%，采用方法a处理淡水青虾，回收率为90.2%～92.6%，符合实验室质量控制要求，可以满足淡水红虾、青虾中的氯霉素残留量检测。

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