黑曲霉和酒糟二次发酵提升低次烟叶品质的研究

邵灯寅,李雨芮,邹恩凯,陈 栋,何 力,杨 蕾,罗海涛*

(1.江西中烟工业有限责任公司技术中心,江西南昌 330096;2.云南农业大学烟草学院,云南昆明 650201)

近年来,工业中低次烟叶库存逐年增加,这极大地阻碍了卷烟行业的发展,有效提升工业库存低次烟叶的品质已经成为烟草行业的一个研究重点。目前,微生物发酵法因具有不受气候条件限制、生产周期短、对环境友好等[1]优点而在我国烟草生产过程中广泛应用。低次烟叶具有刺激性大,伴有较强的生烟感和生青杂气等特点[2]。全铭沁等[3]研究表明黑曲霉发酵液更适合用于降低烟叶的刺激性。许春平等[4]的研究也证实再造烟叶经过黑曲霉降解后烟叶的刺激性明显减轻。黑曲霉(Aspergillusniger)在烟叶发酵中主要用于降低烟叶中淀粉与蛋白质、果胶以及纤维素的含量[5],使之进一步转化分解为葡萄糖等物质,从而降低烟叶的刺激性[6]。

黑曲霉虽然对烟叶的刺激性有较好的改善效果,但黑曲霉无法有效改善低次烟叶中的生青杂气[3],且被其处理后的烟叶劲头明显不足。研究发现,用酒糟发酵食醋时会产生甘油、脂肪酸等香味物质[7],同时酒糟还能为多种有利于烟叶醇化的微生物提供优质氮源、碳源[8],其在发酵过程中还能提高一些蛋白酶的活性[9]。酒糟中含有丰富的矿物质以及钙、铁等微量元素,还含有多种菌体自溶产生的各种生物活性物质(如类脂化合物、酶等)[10]。以上这些特性理论上能够很好地弥补黑曲霉发酵烟叶时的不足,但目前我国对酒糟发酵提质的研究主要集中在牲畜饲料的提质方面,而用于烟叶提质方面的研究较少。为了探究黑曲霉和酒糟二次发酵对低次烟叶的提质效果,笔者利用黑曲霉和自酿米酒酒糟对烟叶进行二次发酵处理,以期为减轻低次烟叶的库存压力提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1烟叶原料。库存低档次上部烟叶,产地为云南大理剑川,由江西中烟技术中心提供。

1.1.2发酵微生物制剂。黑曲霉,实验室保存;米酒酒糟,自制。

1.1.3烟叶液体培养基。将烟叶剪成碎片后用无菌水37 ℃下浸泡12 h,在100 mL培养基中加入0.5 g烟叶碎片,置于115 ℃压力蒸汽灭菌器中灭菌20 min,制成液体培养基,用于培养黑曲霉。

1.2 主要仪器与设备低温离心机,为深圳瑞沃德生命科技有限公司产品;连续流动分析仪,为德国布朗卢比公司产品;气相色谱-质谱联用仪,为美国安捷伦公司产品;同时蒸馏萃取装置,为郑州科技玻璃仪器厂产品;旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂产品;恒温恒湿箱,为德国宾德公司产品;QS-Ⅱ试样切丝机,为郑州天宏自动化技术有限公司产品;加料泵;填烟器为德国GIZEH金字塔填烟器;立体压力蒸汽灭菌器,为上海申安医疗器械厂产品。

1.3 方法

1.3.1样品处理。①黑曲霉菌悬液的制备。挑选黑曲霉单菌落接种至10 mL烟叶液体培养基中,培养至OD600为0.6～0.8(即对数期),离心(4 ℃,4 500 r/min)后将菌体重悬在1 mL 10%葡萄糖溶液(无菌水配制),得到菌悬液。②黑曲霉预处理烟叶的方法。称取含水率12%的烟叶碎片30 g,喷施6 mL制备好的黑曲霉菌悬液,对照样品喷施等量无菌水。将处理后的样品烟叶和对照烟叶装入无菌食品袋中,于温度28 ℃、湿度60%恒温恒湿培养箱中发酵12 h。③自酿米酒酒糟发酵处理烟叶的方法。将烟叶碎片平铺开(尽量不要重叠)并把酒糟涂抹在烟叶碎片上,盖上4层纱布,置于28 ℃培养箱中培养5 d。

1.3.2试验方法。将各处理的烟叶切丝并取适量烟丝进行化学成分和致香成分分析,剩余部分烟丝制成卷烟,用于后续的感官评价。对比各处理前后的烟叶常规化学成分、致香成分和感官质量的变化,确定通过提质处理后烟叶总体品质的提升效果。试验处理设计见表1。

表1 试验处理设计

1.3.2.1常规化学成分测定。参考YC/T 161—2002 《烟草及烟草制品 总氮的测定 连续流动法》、YC/T 160—2002 《烟草及烟草制品 总植物碱的测定 连续流动法》、YC/T 159—2002 《烟草及烟草制品 水溶性糖的测定 连续流动法》、YC/T 217—2007 《烟草及烟草制品 钾的测定 连续流动法》、YC/T 162—2002 《烟草及烟草制品 氯的测定 连续流动法》对烟丝中常规化学成分(总氮、总植物碱、水溶性糖、还原糖、钾、氯)进行测定。

1.3.2.2致香物质的测定及分类。致香物质的样品处理方法与GC/MS分析条件参照文献[11]的方法,以萘作为内标化合物。致香物质的分类方法参考文献[12]。

1.3.2.3样品评价。由专业评吸人员在同一时间分别对单料烟进行评吸,每次抽吸3支卷烟,对每个处理的单料烟进行3次评吸。以T1为对照(CK),对T2、T3处理香气质、量的变化以及口感的改善等方面进行评价。

1.3.3数据处理。数据处理中采用LSD法进行多重比较;利用Microsoft Excel 2019和IBM SPSS Statistics 26软件进行数据统计与分析;使用OriginPro 2021软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 常规化学成分分析烟叶的香气主要反映烟叶的内在品质,烟叶的常规化学成分影响烟气成分的释放效果以及烟草的吃味[13-14]。由表2可知,T2、T3处理总氮、总植物碱、水溶性糖的含量与T1处理存在显著差异,而T2、T3处理间差异不显著。T1、T2、T3处理钾和氯的含量变化不大;T2、T3处理烟叶的总氮、总植物碱含量较T1处理明显下降,T2、T3处理水溶性糖、还原糖的含量较T1处理有所上升;T3处理总氮、总植物碱和还原糖的含量较T2处理略有下降,T3处理水溶性糖的含量较T2处理略有提升。

表2 各处理烟叶常规化学成分含量比较

优质烤烟烟叶化学成分标准如下:总植物碱含量为1.6%～3.0%、总氮含量为1.5%～2.3%、总氮与总植物碱的比值小于1、还原糖含量为8%～18%、还原糖与总植物碱的比值为3～7[15]。利用黑曲霉对烟叶进行预发酵后的低次烟叶化学成分含量几乎达到优质烟叶的水平,这与赵铭钦等[6]的研究结果相吻合;通过酒糟进行二次发酵对预发酵烟叶常规化学成分含量的影响不大。

2.2 烟叶致香物质分析烟草香气质量状况是多种致香物质的组成、含量、比例及相互作用共同决定的[16]。参考文献[4]方法将烟气中致香物质大致分为质体色素降解产物、苯丙氨酸类降解产物、美拉德反应产物、西柏烷类降解产物和其他类致香物质5类,其中质体色素降解产物又可分为类胡萝卜素降解产物和叶绿素降解产物。

2.2.1致香物质检测分析。由表3可知,对T1、T2、T3处理烟叶进行致香成分检测,分别检测出37、41和40种致香物质,致香物质总含量分别为596.112、745.449和787.639 μg/g。与T1处理相比,T2、 T3处理烟叶的大部分致香物质含量明显增加。其中,通过黑曲霉及酒糟发酵处理(T3)后植醇、新植二烯、β-大马酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮D、吲哚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、3-甲基-1-丁醇、己醛、5-甲基-糠醛、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、茄那士酮、西柏三烯二醇、面包酮、肉豆蔻酸、正十六酸、棕榈酸乙酯等致香物质的含量较T1处理均有所增加。与T1处理相比,T2处理植醇、藏红花醛、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮D、苯甲醛、吲哚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、5-甲基-糠醛等致香物质含量的增加幅度超过20%,说明黑曲霉预处理后烟叶的主要致香物质含量明显增加。酒糟二次发酵处理(T3)后的烟叶新植二烯含量较仅经过黑曲霉处理(T2)的烟叶明显增加。新植二烯是叶绿素的降解产物,能够减轻刺激并柔和烟气,同时新植二烯还能够协助烟气中的其他挥发性香气物质进入烟气[13]。该结果也进一步证实黑曲霉发酵能够降低烟叶的刺激性。

2.2.2各类别致香成分含量变化。由表4可知,发酵处理前后烟叶的主要致香物质除苯丙氨酸类降解产物外含量都存在明显变化,其中其他类致香物质的变异系数最大,为45.554%;苯丙氨酸类降解产物含量的变异系数最小,变异系数为7.705%。其他类致香物质含量最高,美拉德反应产物的含量最低。由表5可知,除西柏烷类降解产物外,T2、T3处理的叶绿素降解产物、类胡萝卜素降解产物、苯丙氨酸类降解产物、美拉德反应产物、其他类致香物质的含量均高于T1处理,其中叶绿素降解产物、其他类致香物质和类胡萝卜素降解产物的含量明显增加,这对于烟叶香气质量有着非常明显的正向作用[17]。

表4 烟叶主要致香物质含量分析

表5 各处理主要致香物质含量的比较

2.3 感官质量评价结果各处理感官评价结果如下:T1,生烟感比较强,生青、木质杂气明显,青滋香稍重,鼻腔刺激明显,口腔有苦涩感;T2,舌面刺激减小、劲头稍显不足、烟香成熟感有所增加、香气醇和感明显提升、余味回甘回甜、有其他香气产生、略有清香;T3,提升烟香成熟感的作用明显,香气透发性、质感均有所提升,甜润感增加,清香偏弱,烤甜香增加,香气整体协调,烟香醇和感明显提升,余味舒适,品质提升明显。由此可见,T2、T3处理烟叶感官质量相较于T1处理显著提升,而T3处理烟叶感官质量较T2处理也有明显改善。T2处理相较于T1处理烟叶感官质量的上升主要体现在刺激性明显下降且烟香更加协调,而T3处理相较于T2处理烟叶感官质量的改善主要体现在香气质感和整体协调性的上升。总体来看,感官质量的改善主要体现在烟叶刺激性的降低以及生青杂气的掩饰;经过处理的烟叶甜感和烟香成熟感逐渐增加,清香型风格逐渐变弱,烟气的烤甜香逐渐增加。二次发酵虽然能使烟叶香气协调且能提升烟气的质感、醇和性以及透发性,但是烟叶的清香风格可能会被掩盖,烤甜香会有所增加。

3 结论

经酒糟与黑曲霉二次发酵处理的低次烟叶相较于未经处理的低次烟叶无论从化学成分、致香物质的种类及含量还是感官质量方面都有较大提升,虽然处理后的烟叶清香风格会有所掩盖,但总体来看经过该方法处理的低次烟叶能够很好地改善烟叶品质。该试验结果可为后续酒糟发酵及黑曲霉发酵工艺在工业中的进一步应用提供有力的理论支持,今后还要进一步完善其中试放大工艺条件,以加快其在低次烟叶提质中的推广应用。