基于COI基因分析叶尔羌河5种鲤科鱼类遗传多样性

张小雨,靳文慧,王 佳,王玉涛

(喀什大学生命与地理科学学院/新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室,新疆喀什 844000)

叶尔羌河位于新疆塔里木盆地的西南面,起源于世界第二大高峰——乔戈里峰,属于塔里木河水系[1-2]。流域内分布的鱼类主要为鲤形目的鲤科和鳅科,土著鱼以高原鳅属和裂腹鱼属为主,普通经济鱼类由鲤鱼、草鱼、鲫鱼等构成[3]。目前,与叶尔羌河流域相关的研究日益增多,主要集中在水利水电工程[4]、环境科学和资源利用[5]等方面,但从分子水平对该流域鱼类资源状况的研究鲜见报道。因此选取适宜的方法对该流域鱼类资源进行鉴定及进一步的系统进化分析极为重要。

王德忠[6]、杨天燕等[7]、陈生熬等[8]均通过形态学的方法分别分析了新疆裂腹鱼的分布特性和遗传差异以及叶尔羌高原鳅的种群结构。李国刚等[9]也曾对塔里木河等水系的土著鱼类资源展开调查,发现了水系的特有鱼类。随着种质资源鉴定技术的进一步发展[10]。其中,COI(线粒体细胞色素C氧化酶亚基 Ⅰ )基因的引物通用性和进化速度[11]均处于较高水平,而且它的5′端序列的种间差异显著高于种内,所以,mtDNA基因被视为物种鉴定的理想基因条形码之一[12]。2003年,Hebert等[13]首次提出COI基因可以作为基因条形码对物种进行有效鉴定的观点。此后,Gomes等[14]利用COI基因对爬行类物种和鱼类进行鉴定,说明COI基因作为遗传标记鉴定物种的有效性。闫亚利等[15-17]也选择COI基因对鱼类种质鉴定进行研究。该研究基于COI基因序列对叶尔羌河流域5种鲤科鱼类的遗传多样性进行分析,探讨COI基因作为分子标记对叶尔羌河鱼类进行鉴定的有效性和适应性,有助于对叶尔羌河鱼类资源状况展开调查,为该流域鱼类资源的合理开发及利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料从塔什库尔干县、麦盖提县等地的叶尔羌河流域采集鱼类样品共50尾。参照《新疆鱼类志》[18]对采集的鱼类样本进行形态学初步鉴定,拍照记录每个样本,并剪取鱼鳍组织浸泡于95%无水乙醇,分组编号后保存于-80 ℃冰箱。

1.2 DNA提取、扩增及测序利用传统的酚-氯仿法,提取叶尔羌河5种鱼类鱼鳍或鱼肉组织的DNA。该研究相关引物采用鱼类通用引物(FISH-F1:5′-TCAACCAACCACAAAAAGACATTGGCAC-3′;FISH-R1:5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′;FISH-F2:5′-TCGACTAATCATAAAGGATATCGGCAC-3′;FISH-R2:5′-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3′)[19]扩增COI片段。PCR反应体系为20 μL,包括2×TaqPCR Mix 12 μL、上下游引物(10 mmol/L)各0.4 μL、DNA模板1 μL、ddH2O加至20 μL;PCR扩增程序:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,58 ℃复性30 s,72 ℃延伸1 min,以上步骤经35个循环之后,再72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,合格后送样测序。

1.3 数据处理使用Chromas软件查看正反双向测序结果峰图,然后使用DNAStar软件包进行序列的拼接、比对和校对;利用DnaSP 5.10软件计算叶尔羌河5种鱼类群体单倍型,并统计变异位点数、单倍型多样性指数(Hd)、核苷酸多样性指数(Pi)、核苷酸差异数(K)等;采用MEGA 7.0软件计算序列核苷酸组成和遗传距离等,并结合下载的12条同源序列(具体信息见表1)基于NJ法构建系统进化树。

表1 样本名录及相关信息

2 结果与分析

2.1COI基因序列特征该研究通过比对和分析叶尔羌河5种鱼类样本的COI基因片段序列,再结合从NCBI下载的12条已知的线粒体基因序列,最终保留675 bp的序列。分析结果表明(表2),叶尔羌河流5种鲤科鱼类COI基因序列的平均碱基含量分别为T 28.4%、C 28.2%、A 25.6%、G 17.8%,其中鸟嘌呤含量最低,胸腺嘧啶含量最高,且5种鱼类的COI基因片段序列的A+T含量明显高于G+C,展现出显著的A/T偏倚性。该研究序列中的变异位点146个,没有发现碱基的插入/缺失,平均转换位点和颠换位点分别为41和13,平均碱基转换/颠换(R值)为3.2。

2.2 遗传多样性分析对叶尔羌河5种鱼类COI基因的Hd、Pi和K值进行统计(表3),共发现变异位点146个,其中包括了145个简约性信息位点,1个单一多态位点。整体的Hd、Pi和K值分别为0.838、0.079 39和53.589。在单倍型多样性指数(Hd)中,塔里木裂腹鱼最高(Hd=0.509),鲤鱼其次(Hd=0.500),均表现出较高的单倍型多样性,而鲫鱼(Hd=0.473)、斑重唇鱼(Hd=0.286)和宽口裂腹鱼(Hd=0.118)的单倍型多样性指数则较低;在核苷酸多样性指数(Pi)中,鲫鱼最高(Pi=0.003 18),宽口裂腹鱼最低(Pi=0.000 17),表明叶尔羌河5种鲤科鱼类群体的核苷酸多样性均处于较低的水平。

表3 叶尔羌河5种鱼类COI基因序列遗传多样性参数

通过MEGA 7.0软件对叶尔羌河流域5种鱼类的遗传距离进行统计,结果表明(表4),该研究5种鱼类的种内遗传距离为0～0.003 2,平均值为0.001 6,其中鲫鱼的种内遗传距离最大(0.003 2);种间距离为0.002 4～0.150 5,平均值为0.088 8。其中,斑重唇鱼和鲫鱼的种间遗传距离最远(0.150 5);塔里木裂腹鱼和宽口裂腹鱼的种间遗传距离最小(0.002 4),推测与两者亲缘关系较近有关。

表4 基于COI基因序列的叶尔羌河流域鱼类群体遗传距离

2.3 单倍型分析采用DnaSP 5.10软件检测该研究中50个样本的COI片段,一共获得146个多态性位点,10个单倍型。其中,Hap1、Hap2在斑重唇鱼中特有;Hap3、Hap5在塔里木裂腹鱼中特有;Hap4在宽口裂腹鱼中特有;Hap6、Hap7、Hap8在鲫鱼中特有;Hap9、Hap10在鲤属的鲤鱼中特有。

2.4 系统进化树的构建以黄颡鱼(Tachysurusfulvidraco,MH317141.1)作为外群,采用邻接法(neighbor-joining method,NJ)来构建系统发育树。如图1所示,该研究中的5种鱼类在系统发育树上的位置清晰,共分为4大支。其中,第一组宽口木裂腹鱼(Schizothoraxeurystomus)和塔里木裂腹鱼(Schizothoraxbiddulphi)聚为一支;第二组鲤鱼(Cyprinuscarpio)聚为一支;第三组斑重唇鱼(Diptychusmaculatus)聚为一支;第四组银鲫(Carassiusgibelio)、鲫鱼(Carassiusauratus)聚为一支。其中,鲫属、重唇鱼属、鲤属分别单独形成一支,裂腹鱼属的宽口裂腹鱼和塔里木裂腹鱼则共聚为一大支,表明两者的亲缘系较近。

图1 基于NJ法构建的叶尔羌河5种鱼类聚类关系Fig.1 Clustering relationship of five fish species in Yarkant River based on NJ method

3 结论与讨论

该研究对叶尔羌河50个鱼类样本的线粒体COI基因序列进行分析,结果显示在碱基组成上,碱基T含量最高(28.4%),碱基G最低(17.8%),且碱基A+T的平均含量(54.0%)明显高于G+C的平均含量(46.0%),这与张桂宁等[17,20-21]的研究结果类似,即表现出明显的A/T碱基偏倚性,与鱼类mtDNACOI基因序列的碱基特征相符。

遗传多样性的大小通常通过Hd和Pi判断,两者的数值越大表示遗传多样性越丰富[22]。1998年,Grant等[23]首次提出以0.5作为单倍型多样性的临界值,以0.005作为核苷酸多样性的临界值。该研究中,塔里木裂腹鱼和鲤鱼均表现出较高的单倍型多样性(Hd≥0.5)和较低的核苷酸多样性(Pi<0.005),表明其可能正处于群体的快速扩张阶段[24],任永丽[20]通过线粒体COII和ND4基因序列分析3个塔里木裂腹鱼群体发现其单倍型多样性和核苷酸多样性均较高,推测可能是由于脊椎动物不同线粒体基因序列的进化速率不同[25]或与地理隔离有关。而斑重唇鱼、宽口裂腹鱼和鲫鱼均表现出较低的单倍型多样性(Hd<0.5)和核苷酸多样性(Pi<0.005),推测其可能正经历群体瓶颈效应[26]。

该研究中的叶尔羌河5种鲤鱼类的种内平均遗传距离和种间平均遗传距离分别是0.001 6和0.088 8,符合Hebert等[13]提出的种间遗传距离需要大于种内遗传距离的10倍以上,这是利用mtDNACOI基因作为有效鉴定物种的前提。但是该研究中的塔里木裂腹鱼与宽口裂腹鱼群体之间的遗传距离最小(0.002 4),远低于Herber等[27]提出的物种间最小遗传距离(0.02),说明该研究中基于COI基因作为分子标记未能成功区分塔里木裂腹鱼和宽口裂腹鱼,这与海萨·艾也力汗等[26]基于COI基因分析塔里木和流域裂腹鱼属的研究结果一致。此外,通过分析系统进化树表明,在属的阶元上,该研究中的鲤科4属5种鱼类,即重唇鱼属、裂腹鱼属、鲫属和鲤属分别聚为一支,分类明确。但是裂腹鱼属的塔里木裂腹鱼和宽口裂腹鱼的分类上并不是很清晰。总的来说,以mtDNACOI基因作为分子标记,对叶尔羌河鱼类进行种质鉴定和多样性分析是可行的,但是对于裂腹鱼属最好搭配其他线粒体DNA序列作为分子标记来分析效果更好,如D-loop区[28]、Cytb[29]、COII[30]等。

该研究只分析了叶尔羌河流域5种鲤科鱼类的遗传多样性,后续可以进一步对叶尔羌河流域不同区域开展更为详细的资源调查与遗传多样性评估,从而丰富对叶尔羌河流域鱼类资源状况的了解,也有助于濒危鱼种保护、资源合理开发利用和生态环境改善等。