基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS的痂状炭角菌子实体化学成分分析

王志花, 刘国庆, 韩东晶, 周 宁, 杨少华, 汪文君

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

炭角菌(Xylariasp.)属真菌集中分布在温带、亚热带和热带地区,其中的主要化学成分是萜类、生物碱、甾醇及聚酮等次生代谢产物,已发现炭角菌的菌丝体或发酵液具有抗炎[1]、细胞毒[1]、抗真菌[2]、抗菌[3]、抗疟[4]、抑制α-葡萄糖苷酶[4]、抗线虫[5]和神经保护活性[6]。近年来,从炭角菌中不断发现一些新的生物活性成分[7-11]。表明该真菌属可能是开发药用化合物的一个有前途的来源。目前,炭角菌的研究工作主要集中在化学成分的分离与鉴定及药理作用研究等方面,使用液质联用技术对痂状炭角菌(Xylariasp.L1)子实体化学成分进行分析的相关报道并不多[12]。本课题组于 2019年开始该菌的研究工作,目前已成功驯化一个痂状炭角菌菌种,建立了完善的实验室人工培养方案。前期研究表明,痂状炭角菌具有高效率利用生物质的特点,其发酵底物具有抗氧化的药理活性。本文继续研究该菌子实体活性成分,以明确痂状炭角菌的化学成分,对揭示其化学物质基础及配伍规律具有指导意义。

LTQ-Orbitrap 质谱仪综合了 LTQ 的多级质谱功能以及 Orbitrap 的高分辨能力,可短时间内同时实现母、子离子的高分辨采集和多级质谱碎裂,显著提高了对真菌复杂体系中化学成分的快速鉴定与分析能力[13]。因此,本文采用超高效液相色谱(ultra-high performance liquid chromatography UPLC)-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(quadrupole-orbitrap high-resolution mass spectrometry,Q-Orbitrap HRMS)技术对痂状炭角菌子实体的主要化学成分进行快速、全面地鉴定,便于为进一步阐明该炭角菌的药效物质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

痂状炭角菌(Xylariasp.L1)由本实验室从废弃白蚁窝中分离纯化获得,将痂状炭角菌子实体50 ℃烘干至恒重后,粉碎后36目孔过筛密封备用。

乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯试剂,购于赛默飞世尔科技有限公司;去离子水由Milli-Q 纯水系统制备。

MS105DU电子天平(赛多利斯(上海)贸易有限公司);DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);D3024R速微量冷冻离心机(北京大龙兴创实验仪器有限公司);MX-F涡旋振荡器(武汉赛维尔生物科技有限公司);MTV-100多管涡旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司);JP-040S超声波清洗器(深圳洁盟清洗设备有限公司);UltiMate 3000 RS色谱仪、Q Exactive质谱仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。

1.2 样品的制备

称量样本约 200 mg,加入 1 mL 80% 甲醇[14-15],涡旋混匀。加入2～3颗二氧化锆研磨珠,研磨提取 3 min;4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min。取上清液过 0. 22 μm 微孔滤膜,即得。

1.3 液相和质谱条件

液相色谱条件如下:色谱柱为Welch RP-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相 A 为0.1%甲酸水溶液,流动相B为0.1%甲酸乙腈;流速为0.3 mL/min,进样室温度为10 ℃,柱温为35 ℃;进样量为5 μL;检测波长为200～400 nm。梯度洗脱条件见表 1所列。

质谱条件如下:离子源为电喷雾离子源 (electrospray ionization source,ESI),正负离子模式检测,离子源温度为 350 ℃,鞘气流速为30 L/min,辅助气流速为10 L/min,扫尾气流速为0.2 L/min,喷雾电压为3 800 V,毛细管温度为300 ℃,扫描模式为全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/dd-MS2),一级分辨率 70 000,二级分辨率17 500,二级离子碎片的质荷比(m/z)扫描范围为150～2 000。

2 结果与分析

2.1 痂状炭角菌子实体化学成分鉴定

将UPLC-QE所采集的原始数据导入 Thermo Compound Discover 2.0 (CD) 分析软件进行初步计算,该软件可充分利用高保真的Orbitrap数据来准确鉴定复杂基质中的化合物,通过定制相应的工作流程,结合了多种识别技术,包括与 mzCloud 库、mzVault库、Chemspider 库进行碎片及分子量匹配,从而初步筛选得出痂状炭角菌子实体提取物中可能存在的化合物。此外,借助 Thermo Xcalibur 2.2 分析软件对质谱数据进行进一步分析和处理,根据高分辨质谱信息对其分子式进行推导,偏差不得大于5×106,对照参考文献和上述在线数据库,推导可能的裂解碎片,最终确定痂状炭角菌子实体提取物中存在的化合物,该提取物的ESI-MS质谱总离子流图如图1所示,其化学成分鉴定结果见表2所列。

图1 痂状炭角菌子实体提取物的ESI-MS 质谱总离子流图

表2 痂状炭角菌子实体提取物化学成分鉴定结果

2.2 萜类化合物

萜类化合物以单萜、二萜、三萜及倍半萜等形式存在,本实验从痂状炭角菌子实体提取物中共鉴定了 6种萜类化合物,包括3种三萜和3种倍半萜。在二级碎裂过程中,萜类化合物的裂解特征主要为H2O、CO2H自由基和HCO2H分子离子的损失。以化合物25和27为例,化合物27,tR=17.36 min,正离子模式下得到准分子离子m/z为456.360 30的[M+H]+,预测其分子式为C30H48O4。母离子失去1个—OH形成m/z为439.356 230的[M+H-OH]+,再经过裂解形成2个离子碎片,其m/z为245.189 88、 175.148 15,前者依次失去—COOH和—C6H12形成碎片离子m/z为201.163 71的[M+H-COOH]+和m/z为119.085 76的[M+H-COOH-C6H12]+,后者丢失一分子甲基自由基形成m/z为161.132 57的[M+H-CH3]+。参考文献[16-17]分析其可能的裂解途径,结合在线网络数据库比对鉴定该化合物为齐墩果酸。质谱裂解途径如图2所示。同样,对于化合物25,其在正离子模式下准分子离子为m/z为942.517 83的[M+H]+和m/z为965.506 35的[M+H+Na]+,二级质谱中存在m/z为796.373 03[M-rha]+、m/z为615.393 01 [M+H-rha-gal-H2O]+、m/z的439.356 23[gal+H-H2O]+等碎片离子。根据文献[18]比对,可以确定该化合物为大豆苷元。根据上述总结,推断化合物15、16、24、41分别为园柚酮、花姜酮、大豆皂苷Ⅱ和藿香醇。

图2 齐墩果酸可能的裂解途径

2.3 不饱和脂肪酸类化合物

本实验从痂状炭角菌子实体提取物中共鉴定了10个长链不饱和脂肪酸,其裂解方式相似,二级质谱中主要丢失 H2O、HCOOH、CO2等中性分子。以化合物34为例,在负离子模式下得到准分子离子m/z为303.230 57的[M-H]-,预测其分子式为C20H32O2。二级质谱中可见失去1分子 H2O形成的碎片m/z为285.222 20的[M-H-H2O]-,或依次失去1分子C7H13和1分子C3H5形成的碎片m/z为205.195 43的[M-H-C7H13]-、m/z为163.075 61[M-H-C3H5]-,或依次失去1分子HCOOH和1分子C2H4,形成的碎片m/z为259.242 86的[M-H-HCOOH]-、m/z为231.210 82的[M-H-HCOOH-C2H4]-。

经过数据库检索及与文献[19]比对,可推断该化合物为花生四烯酸。质谱裂解途径如图3所示。

图3 花生四烯酸可能的裂解途径

同理,根据相对分子质量、碎片离子与MassBank数据库比对结果,推断化合物19、26、28、29、31、33、35、38、39分别为芥子酸、棕榈油酸、16(R)-HETE、二十碳五烯酸、11(Z),14(Z),17(Z)-二十碳三烯酸、α-桐酸、亚油酸、二十二碳三烯酸、油酸。

2.4 生物碱类化合物

本实验从痂状炭角菌子实体提取物中共鉴定了14种生物碱类化合物,包括化合物1～14。生物碱多以正离子形式存在,因此正离子模式响应很强,且二级质谱碎片离子多是以N+为中心发生断裂,失去若干个甲基[20-21]。例如,化合物1的准分子离子m/z为268.103 52的[M+H]+,C10H13N5O4为其预测分子式,在二级质谱中,失去1分子呋喃核糖残基形成碎片离子m/z为136.061 81的[M+H-C5H8O4]+,再丢失1分子 NH3形成m/z为119.035 46的[M+H-NH3]+,经过数据库检索比对,鉴定该化合物为腺苷。

腺苷可能的裂解途径如图4所示。

图4 腺苷可能的裂解途径

2.5 苯丙素类化合物

本实验从痂状炭角菌子实体提取物中共鉴定了4种苯丙素类化合物,包括1种香豆素和3种黄酮类化合物,已鉴定的多数苯丙素的结构相似,裂解特征主要为丢失 CO、CO2、CH3等中性分子。以化合物20和23为例。化合物23,tR=16.22 min,正离子模式下得到准分子离子m/z为163.038 60的[M+H]+,预测其分子式为C9H6O3。在二级质谱中,可见其分别丢失1分子CO或1分子CO2形成的碎片离子m/z为135.044 11的[M+H-CO]+、m/z为119.085 77的[M+H-CO2]+。根据化合物的二级质谱裂解特征,经过数据库检索及与文献[22]比对,确认该化合物为7-羟基香豆素。质谱裂解途径如图5所示。化合物20,负离子模式下得到准分子离子m/z为269.045 750的[M+H]+,预测其分子式为C15H10O5。在二级质谱中,可见其分别丢失1分子CO或1分子C8H7O形成的碎片离子m/z为241.050 42的[M+H-CO]+、m/z为151.002 49的[M+H-C8H7O]+。根据化合物的二级质谱裂解特征,经过数据库检索及与文献[23]比对,确认该化合物为染料木黄酮,质谱裂解途径如图6所示。

图5 7-羟基香豆素可能的裂解途径

图6 染料木黄酮可能的裂解途径

图7 过氧化麦角甾醇可能的裂解途径

2.6 甾体类化合物

本实验从痂状炭角菌子实体提取物中共鉴定了7种甾体类化合物,分别为睾酮、7α-羟基睾酮、孕酮、5α-二氢睾酮、11-酮本胆烷醇酮、过氧化麦角甾醇、诺龙葵酸酯。甾体类化合物A环和C环的合适位置上有双键,容易进行RDA反应,产生RDA反应的产物离子。以化合物40为例,准分子离子m/z为429.335 97的[M+H]+,其预测分子式为C28H44O3,在二级质谱中,依次失去1分子水和1分子C9H12形成碎片离子m/z为411.325 29的[M+H-H2O]+、m/z为287.200 81的[M+H-H2O-C9H12]+,产生A环和D环上的烯键,接着进行RDA反应产生RDA产物离子m/z为191.106 63的[M+H-C4H6-C3H6]+,经过数据库检索,及与文献[24]比对,推断该化合物为过氧化麦角甾醇。质谱裂解途径如图 7所示。

3 结 论

本文采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术快速、全面地对痂状炭角菌(Xylariasp. L1)子实体的化学成分作出鉴定,最后确定成分有6种萜类、10种长链不饱和脂肪酸、14种生物碱、4种苯丙素、7种甾体类。在鉴别出的41种成分之外,痂状炭角菌子实体提取物中有一些响应较好,但在已有的数据库中未找到相应的分子量,说明痂状炭角菌子实体中还有一些未知成分有待于进一步研究。

本实验从痂状炭角菌子实体中鉴定出的化学成分与前人分析炭角菌属的化学成分有较大不同,倍半萜类化合物园柚酮、花姜酮,甾体类化合物睾酮、7α-羟基睾酮、孕酮、5α-二氢睾酮、11-酮本胆烷醇酮以及8种长链不饱和脂肪酸类化合物芥子酸、16(R)-HETE、二十碳五烯酸、11(Z),14(Z),17(Z)-二十碳三烯酸、α-桐酸、亚油酸、二十二碳三烯酸、油酸。在过去的研究中并不多。大豆苷元、黄豆黄素和染料木黄酮也为首次从炭角菌中鉴定出来,可能与本实验用豆渣作为炭角菌的培养基有关。

本实验虽然色谱峰没有完全分开,但是通过数据库比对确定总离子流图中的化学成分,排除外界干扰,对不同种类的化合物进行部分质谱解析。研究结果表明,UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技术可以快速系统地鉴定痂状炭角菌子实体的化学成分,并对其化学成分进行初步的探索,可为该真菌的合理利用与开发提供依据。