华北棕壤土掺砂比对渗滤系统净化污水性能的影响

王 滢，胡伟武，陈 男，冯传平

(中国地质大学(北京)水资源与环境学院，地下水循环与环境演变教育部重点实验室，北京 100083)

0 引 言

据2020年城乡建设统计年鉴显示，我国各省市对生活污水进行处理的建制镇占总量的65.4%，但进行处理的村镇在总村镇中占比较低，全国平均值仅35%[1]。当前，农村地区生活污水的随意排放对水环境质量造成严重威胁，污水中的氮磷极易导致水体富营养化、河道黑臭等[2-3]。因此，对农村生活污水的治理成为改善村镇水环境质量的关键。相比城市生活污水，村镇污水排放总量低且在时间和空间上分散，宜采用建设成本低，维护管理简单的就地处理技术，在土地资源丰富的村镇地区，土壤渗滤技术具有很大的应用潜力[4]。该系统能充分发挥土壤自净能力，依靠物理截留、化学沉淀与微生物转化三重机制实现污染物的有效转化去除[5]。基质填料作为系统的核心，具有物理吸附截留与微生物载体的双重作用，然而单一土壤长期过水后易发生压实而导致系统堵塞，使得净化性能失效，必须向土壤中添加其他材料来维持系统长期稳定的渗透性；此外，为获得较大水力负荷，系统通常不断注入生活污水，基质在饱和水流中通常是厌氧还原的，不利于硝化反应进行，导致氨氮去除率通常为60%～87%[6-7]。

为提高系统渗透性能与氨氮去除率，目前大多研究聚焦于人工曝气、改变系统结构或填料组成上[8-10]，曝气虽能促进有机物和氨氮去除[10]，但造成了大量能耗。据报道，人工湿地中低能耗增氧方式有潮汐流运行和设置部分不饱和区[11]，如Zheng等[12]在模拟人工湿地(SCWs)中设置了恒定不饱和带，测得不饱和区末端DO含量(5.03±0.54 mg·L-1)远高于饱和区，COD去除率稳定在83%±5%，氨氮去除率约45%±10%，不饱和区有效补充了氧含量，是一种有前景的生态高效供氧方法。

因此，本研究考虑将土壤基质与矿物填料混配来增加基质的孔隙率和渗透性能，结合不饱和流运行来强化自然复氧。由于土壤中掺砂比例不同时，系统孔隙率存在差异，这势必会影响土体内氧环境，而对好氧-厌氧环境的控制是实现污染物在不同空间高效去除的关键，有必要阐明掺砂比例对氮、磷污染物转化以及相关酶活性的影响，揭示不同掺砂比下微生物的群落结构与功能，得出适宜硝化与反硝化作用的掺砂比。预期成果将为提升华北棕壤区土壤渗滤系统净化效率、提高系统生物多样性与稳定性，以及组建和优化模块化土壤渗滤基质提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验装置

如图1，实验装置为4个内径4 cm、高30 cm的有机玻璃柱，柱由下而上填充，承托层为2 cm厚的石英砂，填料层高度20 cm，S0填充绿沸石，S30、S50和S70中填充均匀混合填料，S30中土壤:石英砂:火山岩=30%:60%:10%(质量比，下同)，S50中土壤:石英砂:火山岩=50%:40%:10%，S70中土壤:石英砂:火山岩=70%:20%:10%。通过排水法得4个柱孔隙率依次约为0.51、0.48、0.43和0.41，布水层为2 cm厚的石英砂。土壤取自中国地质大学(北京)校内花园表层，为典型砂质棕壤土，去除杂质自然风干后过2 mm筛备用，沸石、石英砂与火山岩购自河南省巩义市净水材料有限公司，粒径均为1～3 mm。基质装填完成后，先用去离子水冲洗多次，使得出水氨氮浓度低于检出限，4个渗滤柱均不添加活性污泥。

图1 渗滤实验装置示意图Fig.1 Schematic diagram for the percolation experimental device

1.2 实验用水

模拟污水参照《华北地区农村生活污水处理技术指南2010》(试行)中推荐的参考值配制：COD、NH4+-N、TN和TP质量浓度分别为350、40、50、5 mg·L-1左右，具体为向自来水中加入0.328 g·L-1C6H12O6、0.1528 g·L-1NH4Cl、0.022 g·L-1KH2PO4和0.022 g·L-1CO(NH2)2。

1.3 运行方法

模拟污水经蠕动泵提升到顶部后滴滤进水，为增强布水均匀性，在填料表面铺一层亲水滤纸并定期更换。实验在(25±3.5)℃进行，阶段一：1～40 d，每天进水6 h，进水量5.23 mL·h-1，水力负荷0.025 m3·m-2·d-1；阶段二：40～70 d，每天进水6 h，进水量13.08 mL·h-1，水力负荷0.0625 m3·m-2·d-1；阶段三：70～96 d，每天进水24 h，进水量为5.23 mL·h-1，水力负荷为0.1 m3·m-2·d-1，每2～3 d分别取2次进出水样品。

1.4 分析方法

土壤酶活性及微生物群落结构分析：实验结束时，取4个柱内顶层(0～5 cm)、中层(9～13 cm)与底层(16～20 cm)填料各2份，一份室温自然风干，采用索莱宝土壤系列试剂盒分析土壤脲酶(S-UE)、碱性磷酸酶(S-AKP/ALP)、蛋白酶(S-ALPT)以及中性转化酶(S-NI)活性(S0除外)。一份充分混匀后于-20 ℃冰箱中冷冻保存至分析，样品基因组DNA按照 FastDNA©SPIN试剂盒的说明书进行提取，并利用Nanodrop分光光度计对提取的DNA浓度进行检验，对16S rRNA基因V3—V4区进行PCR扩增，扩增引物为338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，高通量测序分析由美吉生物公司完成，测序平台为 Illumina MiSeq。

统计分析：采用SPSS 20.0软件进行单变量方差分析和相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 污染物去除性能

图2 NH4+-N去除性能与去除率Fig.2 NH4+-N removal performance and removal efficiency

图3 不同运行阶段与质量浓度变化Fig.3 Changes of (a)and (b)concentration in different operation stages

图4为磷去除性能分析结果。阶段一S0去除率均值仅59%，显著低于含土壤的3组(84%～87%)(P<0.05)。阶段二S0磷去除率降低到47%，显著低于S50与S70(P<0.05)。阶段三S0、S30、S50的磷平均去除率在10%～50%之间，仅S70达到了70%。相比于沸石，土壤对磷的去除性能优异，因此增大掺砂比会降低磷去除率，需要在后续阶段补充高效除磷材料。此外，实验中所有系统对磷的去除波动较大，这可能是由于非饱和流态下，填料未与磷酸盐充分接触[18]。阶段三的磷去除率均逐渐降低甚至溶出与祁娜[19]研究中未见磷吸附达到饱和存在差异。为此，评估了4个系统的磷酸盐平均吸附量(假设磷酸盐仅通过吸附去除，溶出时即达到吸附饱和)，S0为47 mg·kg-1(沸石)，S30、S50和S70分别为178.8、123.5、117.8 mg·kg-1(土壤)，而祁娜[19]研究中沸石理论最大吸附量为880 mg·kg-1，显著高于本研究；土壤理论最大吸附量为 200 mg·kg-1，略高于本研究。因此，本研究后期磷去除率降低与棕壤土的磷饱和吸附量低有关，并且由于本研究实验装置尺寸也较小，柱内土壤添加量低，使得Ca、Fe、Al等有效除磷物质在较短时间内就达到了饱和。

图4 出水磷酸盐质量浓度(a)和磷酸盐去除率(b)(负值表示磷酸盐的溶出)Fig.4 Phosphate concentration of effluent (a)and phosphate removal efficiency (b)(negative value indicates phosphate dissolution)

2.2 微生物群落结构分析

2.2.1 多样性分析

在97%相似度下将测序所得序列聚类为用于物种分类的OTU，样品的Coverage指数均在0.98以上。数据抽平后进行Alpha多样性分析，由表1知，与原始土壤相比，S30、S50与S70土壤样品Sobs、ACE与Chao指数均增大，且三组指数值无显著差异(P>0.05)，经污水渗滤后，土壤群落丰富度均有提高。S0依靠填料自然挂膜，群落丰富度与多样性均较低，表明填料表面存在优势微生物。与原始土壤相比，S30的Shannon指数下降，微生物多样性降低，而S50与S70的Shannon指数增大，微生物多样性增加，且S50最大，这可能与其含有更多适宜好氧厌氧微生物生活的微环境有关。

表1 Alpha多样性指数Table 1 Alpha diversity index

2.2.2 细菌群落组成

通过主成分分析(PCA)和聚类分析比较了不同掺砂比下的群落结构差异(图5(a)和(b))，PC1和PC2的解释量分别为41.99%和22.05%。初始土壤与S0分别单独为一簇，S30、S50与S70聚为一簇，掺砂比对群落结构影响不大。聚类分析也表明有无污水渗流是影响土壤细菌群落结构的因素，且S0自然挂膜形成细菌群落与土壤细菌群落结构明显不同。4个柱的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、绿弯菌门(Chloroflexi)和拟杆菌门(Bacteroidota)，占所有细菌丰度的82%～91%。经污水作用后Proteobacteria、Bacteroidotas和Nitrospirota相对丰度较原始土壤有所增加，但Actinobacteriota相对丰度降低。Proteobacteria在S0、S30、S50和S70中相对丰度依次为65.1%、34.9%、27.0%和25.3%，该门微生物种类多，是C、N、S等污染物转化的主要参与者[20]。Liu等[21]利用沸石过滤器在高碳源浓度下脱氮时Proteobacteria相对丰度也超过了60%，与S0一致。Actinobacteriota大多为化能异养型细菌，固氮能力较强，可分泌大量胞外酶促进有机物如含氮聚合物的分解，对反硝化作用不大[22-23]，在4个柱中相对丰度依次为14.6%、27.0%、28.0%和31.6%。Acidobacteriota在土壤环境中丰富多样，可参与有机质的代谢包括腐殖质的分解，对环境中铁的循环有一定作用[24-25]，相对丰度分别为1.9%、8.7%、12.4%和11.9%。Chloroflexi的大多数微生物可将多糖发酵成有机酸和氢，加快土壤有机物分解[26]，相对丰度分别为3.4%、9.4%、10.9%和11.9%。Bacteroidotas相对丰度依次为5.7%、3.8%、3.7%和2.7%，其在利用蛋白质和几丁质方面发挥巨大作用，能够降解DOM中高分子量部分，能够进行反硝化[27-28]。硝化螺旋菌门(Nitrospirota)丰度分别为1.79%、2.27%、2.40%和2.16%，负责硝化过程，在含有土壤基质的3个系统中相对丰度较高，这主要由于硝化菌为自养菌，在S0的高有机碳环境中，与异养菌竞争氧气能力弱，生长受到限制[29]。

图6 细菌群落属水平相对丰度Fig.6 Relative abundance of bacterial community at genus level

Nakamurella能够在细胞内储存大量糖类聚合物[40]，丰度依次为1.1%、1.9%、3.0%和1.2%。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是一种好氧菌，能够降解芳香化合物等复杂有机物[41]，丰度分别为5.06%、3.43%、2.28%和2.16%。此外，Microbacterium也是处理结构复杂有机物方面具有突出的贡献[37]，小月菌属(Microlunatus)在治理磷污染方面呈现优势，为化能有机异养的严格好氧菌，是强化生物除磷(EBPR)过程中的主要聚磷微生物(PAO)之一[42]。微枝形杆菌属(Microvirga)是根瘤菌中的一类新种属，与植物共生时能产生明显的结瘤，即具有显著的固氮活性[43]，Ensifer也具有固氮的功能[44]。

2.3 土壤酶活性分析

图7为不同深度与碳氮磷转化相关的土壤酶活性变化，S30表层脲酶活性最高，而S50脲酶活性随深度增加而增大，S70脲酶活性与高度变化无明显关系；蛋白酶活性与深度变化无明显相关性，S30不同深度的活性均较低，S50表层与中层活性较高，而S70底层活性较高；对于磷酸酶活性，S30随深度增加而增加，S50和S70却随深度增加而降低；转化酶活性均随深度增加而下降，在0～5 cm活性最高，这与进水区富含有机质有关。掺砂比对土壤酶活性影响不大，不同深度的污染物浓度变化可能是影响酶活性的直接因素。

图7 不同高度处土壤酶活性Fig.7 Soil enzyme activity at different heights(a)脲酶; (b)碱性蛋白酶; (c)碱性磷酸酶; (d)中性转化酶

土壤酶主要由土壤微生物(细菌和真菌)分泌而来，土壤细菌作为土壤酶的主要来源，可能与土壤酶活性存在相关关系。通过分析原始土壤、S30、S50和S70中部分优势细菌属与土壤酶活的相关性发现(表2)，Enterobacteriaceae、Sphingomonas与转化酶活性正相关，Microvirga、Arthrobacter、Nocardioides、Bacillus、MND1与脲酶活性正相关，与硝化作用有关的Nitrospira、Nitrosospira与蛋白酶活性正相关，而Bacillus、MND1以及Xanthobacteraceae与磷酸酶活性正相关。但这些菌属的相对丰度与土壤酶活性的相关性并不显著，可能土壤酶活性与土壤细菌的关系是多元的，内在原因还需要深入到每一类细菌门的性质和功能以及土壤酶活性本身的作用机制等方面的研究[45]。

表2 土壤细菌优势科/属与土壤酶活之间的相关关系Table 2 Correlation between dominant families/genera of soil bacteria and soil enzyme activities

2.4 菌群功能预测分析

为揭示掺砂比对系统好氧-缺氧环境影响，预测了菌群的氧需求表现型丰度，如图8(a)所示。天然土壤中60%为好氧菌，污水渗滤后好氧菌丰度降低为50%左右，而S0自然富集的好氧菌丰度仅接近30%，兼性厌氧菌丰度高达52%，非曝气情况下，矿物填料易富集兼性厌氧菌，而体系内厌氧菌相对丰度S0(5%)低于S30、S50和S70(10%左右)，掺砂比越高，兼氧菌相对丰度越大。

图8 细菌需氧性表型(a)和氮转化有关功能基因丰度(b)预测Fig.8 Prediction of aerobic phenotype of bacteria (a)and functional genes related to nitrogen transformation (b)

如图8(b)，利用KEGG数据库对氮转化相关的6个功能基因模块(M00175：固氮；M00528：硝化；M00529：反硝化；M00530：异化硝酸盐还原；M00531：同化硝酸盐还原；M00804：完全硝化)丰度进行了预测[46]。整体上S30中与氮转化相关的功能基因丰度最高；S0中固氮、硝化与反硝化基因均较少，但同化与异化硝酸盐还原基因较高。张进等[47]对一株好养反硝化菌的研究中发现该菌的主要脱氮途径为同化与异化还原。S50与S70中硝化功能基因丰度低于S30，这可能是受限于氧气传输效率，而反硝化功能基因丰度仍低于S30主要是由于缺乏有机物提供电子供体。

3 结 论

(1)0.1 m3·m-2·d-1的水力负荷下，S0、S30、S50和S70出水NH4+-N质量浓度分别为1.93±0.43、1.88±0.64、3.33±1.24和3.84±0.61 mg/L，磷去除率分别为14%、25%、38%和73%。土壤占比30%时，适宜构建硝化模块，占比50%及以上适宜构建反硝化模块，但需补充反硝化电子供体。

(2)经污水渗滤后，表层土壤转化酶活性均显著高于中下层，成为有机物降解的“热区”。Enterobacteriaceae、Sphingomonas与转化酶活性正相关，Microvirga、Arthrobacter、Nocardioides、Bacillus、MND1与脲酶活性正相关。

(3)绿沸石去除氨氮受水力负荷影响最小，在自然挂膜过程中富集了unclassified_f_Enterobacteriaceae、Arthrobacter、Bacillus等同步硝化好氧反硝化菌。

(4)非饱和区土壤中好氧菌近50%，以固氮和有机物降解为主(Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi)，由于进水中有机物优先用于细菌生长代谢，反硝化作用微弱。