青蒿素及其衍生物在抗肿瘤中诱导细胞死亡的研究进展

金昊儒,赵俊杰,何霄玥,邱毓淇,何 雷

(1.南方医科大学;2.南方医科大学珠江医院内分泌科,广东 广州 510260)

青蒿素(artemisinin,ART)是高效、低毒的抗疟药物,由传统中药黄花蒿分离得到。双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是通过ART的硼氢化钠还原合成的衍生物[1]。为改善DHA半缩醛分子构造的稳定性,人们经过进一步加工后得到了蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯(artesunate,ATS)等化学性质更稳定的药物。

上世纪九十年代初期发现ART及其衍生物具有抗肿瘤活性,其机制主要包括调节细胞死亡(Regulated cell death,RCD)、阻滞或延缓肿瘤细胞生长周期、抗肿瘤血管生成、抑制肿瘤侵袭和转移等。其中RCD作用通过程序性细胞死亡或由细胞内、外应激诱导的细胞死亡来消除不需要的细胞,在抗肿瘤机制中受到极大关注[2]。本文对ART类药物在细胞凋亡、铁死亡、自噬和焦亡等方面的抗肿瘤作用进行综述。

1 ART及其衍生物与凋亡

最初在人类白血病细胞中报道了ART及其衍生物诱导的细胞凋亡,随后发现ART及其衍生物可以通过调节多种因素导致肿瘤细胞发生细胞凋亡。细胞凋亡主要包括内源性途径和外源性途径,穿孔素/颗粒酶通路作为T细胞介导的信号通路也已被定义。内源性途径由B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,bcl-2)家族成员调控及线粒体介导,外源性途径由跨膜蛋白死亡受体(death receptor,DR)介导[3]。DR是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)受体家族成员,与配体结合后以复合物形式激活凋亡蛋白酶引起细胞凋亡。内源性途径和外源性途径都依赖半胱天冬水解酶或称半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族成员参与完成细胞凋亡。

1.1 ART及其衍生物通过内源性途径诱导细胞凋亡ART类药物诱导活性氧簇(reactive oxygen specie,ROS)增多直接影响通路内信号转导,ART及其衍生物可以通过多种方式激活内源性细胞凋亡途径。

1.1.1 上调内在通路促凋亡蛋白表达,促进细胞凋亡 Cabello等证明DHA增加黑色素瘤细胞中佛波-12-肉豆蔻酸-13-乙酸诱导的蛋白质1(Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1,NOXA)表达[4];Mao等证明DHA可增加乳腺癌细胞中Bcl-2样蛋白11(Bcl-2-like protein 11,Bim)表达[5]。

1.1.2 抑制多种抗凋亡蛋白表达,促进细胞凋亡 Du等证明DHA可下调Bcl-2和Bcl-xL表达[6];Qin等证明DHA可减少肝癌细胞中髓系白血病细胞分化蛋白-1(Induced myeloid leukemia cell differentiation protein,Mcl-1)表达[7]。

1.2 ART及其衍生物通过外源性途径诱导细胞凋亡ATS和DHA在杀死结肠癌细胞方面比ART更有效,它们诱导死亡受体5(DR5)在人结直肠癌细胞HCT116和DLD-1中以P53依赖性方式表达,激活死亡受体凋亡途径。Ilamathi等体外研究表明ATS通过靶向信号转导子和转录3(signal transducers and transcripts 3,STAT3)上调死亡受体4(DR4)表达,使HepG2细胞对致敏肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)介导的细胞凋亡敏感[8]。这个研究表明ART类药物上调DR4表达,而不是DR5,提示ART类药物对细胞凋亡途径的影响是比较复杂的。此外,Wang等在研究ART在小鼠皮肤炎症中的抗炎作用时,发现用ART预处理细胞可抑制抗细胞凋亡蛋白(c-IAP1,Bcl-2和FLIP)表达,从而促进细胞凋亡[9]。基于ART类药物的上述作用,Ji等用多种浓度DHA对四种人骨肉瘤细胞系进行实验,结果证明其激活了caspase-3、caspase-8和caspase-9,诱导了细胞凋亡和DNA 损伤[10]。以上研究表明ART及其衍生物可通过多种方式激活外源性细胞凋亡途径。

1.3 ART及其衍生物通过穿孔素/颗粒酶通路诱导细胞凋亡Zhou等报道,DHA有利于γδT细胞(来源于外周血单核细胞和细胞毒性T淋巴细胞)扩增,并增强γδT细胞介导的胰腺癌细胞杀伤活性。上调细胞内穿孔素、颗粒酶B表达和IFN-γ产生可能是DHA影响γδT细胞抗肿瘤活性增加的重要机制,表明ART类药物可影响免疫细胞诱导肿瘤细胞发生凋亡[11]。陈有挺等发现DHA治疗组缺氧诱导因子(HIF-1α)表达强度低于对照组,计数微血管密度(MVD)值低于对照组,凋亡指数(AI)高于对照组,提示DHA对人胆管癌QBC939裸鼠种植瘤具有抑制作用,可能与诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成有关[12]。陈华等观察DHA给药后胰腺癌裸鼠移植瘤体积变化,并通过对肿瘤组织标本Ki-67染色和TUNEL染色检测肿瘤细胞增殖和凋亡情况,发现DHA可通过抑制增殖和诱导凋亡而抑制胰腺癌体内生长[13]。王双佳等观察DHA联合吉西他宾治疗裸鼠胰腺癌效果,发现DHA可增强吉西他滨抗肿瘤作用,其分子机制可能与抑制吉西他宾诱导激活的NF-kB活性增加及下调NF-kB下游靶基因蛋白表达有关[14]。

2 ART及其衍生物与铁死亡

铁死亡是一种以铁积累和脂质过氧化为特征的RCD类型。多不饱和脂肪酸自氧化或脂氧合酶介导氧化导致ROS产生并最终引发铁死亡。在这个过程中,谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)通过氧化谷胱甘肽(GSH)将有毒的脂质氢过氧化物还原为乙醇,对诱导铁死亡至关重要。谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成,其细胞内浓度受胱氨酸/谷氨酸逆转运体(System Xc-)调节,System Xc-阻断、GSH缺乏或GPX4抑制均会破坏其抗氧化功能并引发典型铁死亡。细胞内Fe3+和Fe2+的不平衡,或不稳定铁池中Fe2+的积累也可以刺激ROS产生并引发非典型铁死亡[15]。

有研究表明,ART通过内过氧化物桥切割产生的ROS可杀死寄生虫和癌细胞;同时,ROS积聚会引发铁死亡并影响铁死亡相关蛋白[16]。Yi等报道,用DHA治疗胶质母细胞瘤细胞后,不仅在细胞质中而且在线粒体和脂质水平上都观察到更多的ROS产生,提示ROS引发的铁死亡是DHA诱发细胞死亡的关键组成部分,其中GPX4是主要靶标[17]。Wang等报道,暴露于DHA的原发性肝癌细胞显示出铁凋亡的典型特征,包括ROS和丙二醛水平升高、铁过载、编码System Xc-的溶质载体家族成员SLC7A11和SLC3A2表达下调,从而阻碍谷氨酸和半胱氨酸交换,使用铁凋亡抑制剂(铁抑素-1和甲磺酸去铁胺盐)可显著削弱DHA的抗肿瘤作用[18]。这一系列研究证明ART及其衍生物可通过多种方式如铁代谢途径、System Xc-途径等诱导肿瘤细胞铁死亡。

3 ART及其衍生物与自噬

自噬过程表现为吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹内容物,借此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新,在正常生长发育中起到重要作用。自噬是一种分解代谢过程,可降解溶酶体中聚集或永生的蛋白质、受损细胞器、无活性病原体等。细胞外和细胞内应激,如缺氧、营养缺乏、生长因子耗竭、ROS积累和DNA损伤,可启动自噬发生。多种自噬相关蛋白(ATG)组装成重要复合物,如ULK1复合物、PI3KIII复合物或PI3P结合复合物,以启动吞噬细胞形成。同时,微管相关蛋白1A/1B-轻链3(light chain 3,LC3)被ATG4切割成LC3-I,通过ATG7和ATG3进一步修饰以与脂质磷脂酰乙醇胺(PE)结合生成LC3-II[19]。LC3-II被纳入自噬体前[20],招募各种自噬受体(P62、NBR1、Surf1、NIX/BNIP3L)与LC3-II结合以识别和吞噬目标物质并形成自噬体。最后,成熟的双膜自噬体与溶酶体融合形成自溶酶体并降解隔离其内部物质,随后释放出重要的细胞成分[21]。

在许多癌细胞中ART类药物通过形成LC3或自噬体来诱导自噬。张泽舜等报道DHA可以诱导胶质瘤细胞株(SKMG-4)自噬,自噬相关蛋白Beclin-1及LC3-B表达上升,而凋亡相关蛋白caspase-3却没有明显变化[22],DHA增加LC3-II表达,诱导肝癌细胞HepG2.2.15自噬。此外还发现ATS通过上调ROS,激活AMPK-mTOR-ULK1通路诱导人膀胱癌细胞自噬。Jiang等发现,ATS处理后的结肠癌细胞LC3和beclin-1蛋白表达水平升高,并发现自噬小体,表现出自噬作用。使用自噬抑制剂羟氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ)可显著加强ATS诱导肿瘤细胞的自噬效果[23]。

4 ART及其衍生物与焦亡

焦亡是由细菌、病毒入侵、化疗药物或毒素等因素诱发的Caspase-1依赖性细胞程序性死亡。焦亡相关模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)包括Toll样受体(Toll like receptor,TLR)、细胞内核苷酸结合寡聚化结构域样受体(intracellular nucleotide-binding oligomerization domain like receptors,NLR)和AIM2样受体,它们通过ASC募集Procaspase-1以形成炎性体[24]。Jiang等报道,使用DHA处理食管鳞状细胞癌细胞ESCC后,一些死亡细胞表现出典型焦变形态,如从细胞膜上鼓起大泡、可检测到丙酮酸激酶亚型M2(Pyruvate kinase subtype M2,PKM2)下调、Caspase-8/3激活以及GSDME-NT产生。敲除GSDME和应用Caspase-8/3特异性抑制剂(z-ITED-FMK/Ac-DEVD-CHO)均能显著抑制DHA诱导的焦亡。可见DHA可通过PKM2-Caspase-8/3-GSDME途径诱导ESCC细胞焦亡[25]。以上研究表明,ART及其衍生物诱导的细胞焦亡主要通过激活Caspase-3诱导的GSDME-NT孔形成,这个过程通过Caspase-3与ART类药物诱导的细胞凋亡相关联。

综上所述,ART及其衍生物可以通过细胞凋亡、铁死亡、自噬和细胞焦亡等多种RCD途径诱导肿瘤细胞死亡,发挥明确的抗肿瘤作用。深入研究RCD途径有助于进一步开发ART类药物在肿瘤治疗中的应用,同时为开发靶向RCD通路分子药物提供理论依据。目前ART及其衍生物抗肿瘤效果的临床研究尚待完善,我们也期待更多相关基础与临床研究为其提供有力的临床应用依据。