不同培养条件对黄檗快速繁殖的影响

刘 娜，范香香，丁俊杰

（1.中国科学院新疆生态与地理研究所《干旱区地理》编辑部，新疆 乌鲁木齐 830011；2.蒲城县退耕还林事务中心；3.新疆农垦科学院）

黄檗（Phellodendron amurense Rupr.）又名黄菠萝，芸香科，落叶乔木，是国家二级珍贵树种，也是我国三大珍贵阔叶树种之一。黄檗具有深根性、抗风力强、生长快等特点，对气候适应性强，苗期稍能耐荫，成年树喜阳光。主要分布在我国的黑龙江、吉林、辽宁、河北等省[1]。黄檗树皮木栓层很发达且其中含有一些生物碱，具有重要的经济和药用价值。黄檗树叶随季节而变化，也可用于园林[2]。该树种在新疆各地城市绿化生态园林中得到广泛应用，目前已推广到博乐、奎屯、克拉玛依、乌鲁木齐及和田等地。目前，黄檗已经被列为国家二级保护植物和重点植物保护资源，在《中国植物红皮书》中，将其列为渐危种。

黄檗种皮坚硬，透水和透气性较差，所以种子发芽率较低。扦插繁殖，黄檗不易生根，成活率低，繁殖系数低[3]。组织培养可在短期内得到大量、优质、整齐的组培苗，有可能是解决种苗短缺的有效途径之一。本项目的研究旨在找寻黄檗快速繁殖的最适条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄檗的繁殖材料于2019年5月17日至2019年6月7日采自石河子大学农学院实验站黄檗树上的新鲜幼嫩的茎尖和茎段。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的选择与消毒

于生长期分别采取黄檗幼嫩的茎尖和茎段（长2 cm左右），采用75%的酒精和0.1%的HgCl2进行消毒，经不同时间的消毒灭菌后，建立外植体。

本实验采用75%的酒精（消毒时间：3 s、5 s和8 s）和0.1%的HgCl2（消毒时间：2 min、4 min和6 min）进行消毒，共设9组实验方案。

1.2.2 外植体的接种与培养

首先用自来水将黄檗茎段冲洗干净，再放少许洗衣粉继续冲洗，直到不再产生泡沫；然后将外植体转移至无菌操作台上，先浸入75%的乙醇，然后用无菌水冲洗3～5遍，再用0.1%的HgCl2消毒之后再用无菌水冲洗3～5遍，用无菌滤纸吸干水分；将外植体接种在基本培养基上进行组织培养。

在离体培养条件下，由于各种植物的生物学特性、遗传特性和生态学特性的不一致，它们对营养的要求也不同，因此选择适宜的培养基对黄檗组培至关重要[4]。本实验设置不同6-BA浓度（0.5 mg/L、1.0 mg/L）和NAA浓度（0.5 mg/L、1.0 mg/L）配比的4组MS基本培养基，基本培养基各500 mL。

自从发布军政令后，衢州城实际上成了一座兵城，原来允许每家每户只留一个人看家守院，实际上，衢州的老百姓怕死得要命，早早都卷了细软关门大吉。人一走，商贾全无，这下可苦了八十六军上万张守城官兵的嘴，入城月余，尽管米面不缺，但蔬菜、食油、肉类全无，这让人怎么活啊。刚开始，军纪还严，宪兵管束得也紧，街上少有入室盗物的，但天天吃米饭馒头，有钱也没处使，一些“宁当饱死鬼，不当饿死汉”的家伙开始撬门入室寻找食物。见长官见了也只是轻描淡写地骂两声，于是抢劫之风便从城东刮到城西。实在看不下去了，中将副军长陈颐磊便下令军法从严，法办了几起抢劫打伤老百姓的，局面才平息下来。

培养条件为：蔗糖为30 g/L，琼脂为7 g/L，pH为5.8，温度介于20～25 ℃之间，光暗周期为16/8 h。

培养30 d后，观察并统计9组消毒方案下黄檗组培苗的褐变率、污染率及成活率，通过对比分析，以确定最佳的消毒时间组合。此外，通过统计黄檗组培苗的芽丛数、株高，并观察组培苗长势，以确定最佳6-BA浓度和NAA浓度配比的基本培养基。

1.2.3 腋芽初始培养

利用第一次初始培养得到的黄檗组培苗进行芽的诱导实验。制作不同6-BA浓度（0.5 mg/L、1.0 mg/L）和NAA浓度（0.2 mg/L、0.6 mg/L、1.0 mg/L、1.4 mg/L）配比的8组MS培养基，各250 mL。对基本培养基培养得到的黄檗组培苗进行腋芽的初始诱导培养到8组激素配比的MS培养基中。培养条件为：蔗糖为30 g/L，琼脂为7 g/L，pH为5.8，温度介于20～25 ℃，光暗周期为16/8 h。

培养30 d后，观察并统计组培苗的腋芽数、株高及长势，以确定用于腋芽诱导的最佳6-BA浓度和NAA浓度配比。

1.2.4 腋芽增殖培养

利用第一次腋芽初始诱导得到的黄檗组培幼苗进行腋芽的增殖培养。制作不同6-BA浓度（0.5 mg/L、0.7 mg/L、0.9 mg/L、1.2 mg/L）和NAA浓度（0.5 mg/L、1.0 mg/L）配比的8组MS培养基，各250 mL。对第一次腋芽初始诱导得到的黄檗组培苗的芽丛进行增殖培养到8组激素配比的MS培养基中。培养条件为：蔗糖为30 g/L，琼脂为7 g/L，pH为5.8，温度介于20～25 ℃之间，光暗周期为16/8 h。

培养30 d后，观察并统计组培苗的腋芽增殖数、株高及长势，以确定用于腋芽增殖培养的最佳6-BA和NAA浓度配比。

1.2.5 试管苗生根培养

试管苗的生根培养是组织培养中的重要环节，是快速繁殖幼苗的有力保证[5]。目前，对于组织培养试管苗生根的研究，国内外针对不同植物做了大量的研究。将外植体培养在4组不同NAA浓度（0.1 mg/L、0.4 mg/L、0.7 mg/L、1.0 mg/L）的MS培养基中。培养条件为：蔗糖为30 g/L，琼脂为7 g/L，pH为5.8，温度介于20～25 ℃，光暗周期为16/8 h。

培养30 d后，观察并统计组培苗的生根数、生根率及根的长势，以确定黄檗组培苗生根的最佳NAA浓度。

1.2.6 黄檗组培苗转培

在组织培养中，不同转培时间对黄檗组培苗的影响也很大。本实验共设立了4组转培时间，分别是在接种后的20 d、25 d、30 d、35 d和40 d，将继代培养中的黄檗组培苗分别经不同时间将进行转培，并观察组培苗的株高和生长状态，以确定其最适宜的转培时间。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对黄檗茎段培养的影响

通过对比发现75%的酒精消毒时间为8 s、0.1%HgCl2的消毒时间为4 min时的消毒效果最好（表1），污染率仅为1.2%，褐变率为1.0%，外植体的成活率高达93.1%。从实验可知，当75%的酒精杀毒时间为3 s时，褐变率很低，但是污染率却升高了。当75%的酒精杀毒时间为5 s时，褐变率和污染率都不是很低，外植体的成活率也不高。0.1%HgCl2的消毒方法对实验的影响较小。由此可见，酒精消毒时间过长会引起褐变的数量增加，但是杀菌效果较好；如果酒精消毒时间过短，虽然褐变率降低，但是杀菌效果不是很好。

表1 不同消毒时间对黄檗茎段培养的影响 %

2.2 最佳基本培养基的筛选

经过一段时间的培养，不同激素浓度对黄檗组培苗壮苗的影响效果显著（表2），在第4组培养基中，黄檗幼苗生长极其缓慢，平均株高只有2.7 cm。而第1组和第3组培养基中的黄檗幼苗长势均良好，株高在3.2 cm左右。只有第2组培养基中的黄檗幼苗长势最好，平均株高达到了4.8 cm。因此，在6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L培养基中黄檗组培幼苗生长迅速且状态最好。

2.3 腋芽的初始诱导

在所有的组合中，6-BA 0.6 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培养基对黄檗茎段腋芽的诱导效果最好（表3）。在这种培养基中，腋芽数量较多且黄檗组培苗长势较好。研究发现生长素NAA浓度一定时，芽的抽芽增殖率并不随着细胞分裂素浓度的升高而增大，高浓度的6-BA反而抑制细胞的分化和生长。

2.4 腋芽的增殖培养

在培养基的各种成分中，植物激素的影响最大。在木本植物的组织培养中，常用BA诱导腋芽增殖途径得到无菌苗。在6-BA 0.7 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培养基中，黄檗腋芽增殖倍数最大，达到6倍每株（表4）。组培苗的生长状态也最好，植株生长最高，叶片伸展而且大。由此可见，该浓度适合愈伤组织培养和遗传转化的研究。虽然黄檗在6-BA 0.7 mg/L+NAA 1.0 mg/L培养基中，腋芽的增殖数最大，达到每株6个。但是，腋芽的增殖率并不随着激素浓度的增加而增加，高浓度的激素浓度反而抑制了组培苗的生长。因此，通过本实验，确定了6-BA 0.7 mg/L+NAA 1.0 mg/L为黄檗腋芽增殖的最佳激素浓度。

表4 不同6-BA、NAA浓度对黄檗茎段腋芽增殖的影响

2.5 诱导生根途径

当NAA浓度为0.7 mg/L时处理效果最好，生根的平均条数为4条，根呈绿色且粗壮。而当NAA浓度达到1.0 mg/L时，黄檗的生根率明显降低，根的颜色也由绿色变成黄白色（表5）。这说明较高或者较低的生长素浓度都不利于黄檗再生苗的生根。由此，可以确定黄檗最佳生根激素为NAA 0.7 mg/L。

表5 不同NAA浓度对黄檗生根的影响

2.6 继代培养中不同转培时间对组培苗的影响

黄檗组培苗在培养20 d后，组培苗长势一般，平均株高只有3.1 cm；黄檗组培苗在培养25 d后，组培苗长势较好，叶片也变的伸展了，平均株高为3.4 cm；黄檗组培苗在培养30 d后，组培苗长势最好，叶片大而伸展且颜色翠绿，平均株高为3.8 cm；黄檗组培苗在培养35 d后，组培苗较30 d时长势下降，叶片大但是开始卷曲，平均株高为3.9 cm；黄檗组培苗在培养40 d后，组培苗长势一般，叶片卷曲严重且开始发黄，平均株高为3.9 cm（表6）。所以，黄檗组培苗在培养30 d后进行转培对黄檗组培苗的生长最好。

表6 不同转培时间对黄檗组培苗的影响

3 结论

本实验分别采用了6-BA和NAA研究不同激素组合对黄檗愈伤组织诱导和分化的影响。在接种的最初一周内，外植体开始膨大，膨大到外植体最初体积的2倍；两周左右，外植体开始从切口的边缘分化出愈伤组织。研究发现，不同激素浓度对外植体愈伤组织诱导和再生均有一定的影响。本实验研究结果表明：（1）消毒时间：75%的酒精消毒时间为8 s、0.1%HgCl2的消毒时间为4 min时的消毒效果最好。（2）基本培养基的确定：6-BA 0.5 mg/L +NAA 1.0 mg/L的培养基中黄檗组培幼苗生长迅速且状态最好。（3）腋芽的初始诱导：6-BA 0.6 mg/L +NAA 1.0 mg/L的培养基对黄檗茎段腋芽的诱导效果最好。（4）腋芽的增值培养：6-BA 0.7 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培养基中黄檗腋芽增殖倍数最大，组培苗的生长状态也最好，植株生长最高，叶片伸展而且大。由此可见，该浓度适合愈伤组织培养和遗传转化研究。（5）诱导生根途径：当NAA浓度为0.7 mg/L时诱导生根的效果最好，根呈绿色且粗壮。（6）继代培养中，黄檗组培苗在培养30 d后进行转培对黄檗组培苗的生长最好。