鸢尾素在运动改善去势大鼠骨质疏松中的作用研究

胡丽萍,曹 夏,谢菊英,肖 丽

(湘南学院康复学院,湖南 郴州 423000)

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种全身性骨病,典型特征为骨量低下、骨微结构损坏,从而易发生骨折。目前,我国约有2亿人处于低骨量状态[1],60岁及以上人群OP患病率为36%,随着我国人口老龄化的日趋严重,OP已成为威胁中老年人健康的重要公共问题[2]。运动作为一种重要的非药物治疗手段,能提高肌肉力量和改善平衡,在OP的预防中公认应作为首选。Irisin是骨骼肌对运动的应答而产生的激素类的运动因子,是一种由骨骼肌分泌的Ⅲ型纤连蛋白[3]。OP作为骨代谢异常疾病,与irisin密切相关[4]。研究表明,骨骼肌中irisin的前体物质FNDC5的表达在经过长期耐力运动后显著提高[3]。10周耐力训练后,健康人血液中irisin浓度是不运动人群的2倍[5]。绝经女性骨折的发生率与irisin水平有关[6],而irisin可能通过促进成骨细胞的分化与抑制破骨细胞分化来影响骨代谢。但是,irisin对骨髓间充质干细胞(BMSCs)骨向分化的影响及其作用机制尚未明确。因此,本研究探讨了运动对去势SD大鼠骨代谢的影响及irisin调控骨质疏松大鼠BMSCs定向分化的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

3月龄健康雌性SD大鼠(清洁级),100只,体重180～200g。(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)。按随机数字表法随机,分为空白组、模型组、假手术组、运动组和模型+irisin注射组,每组各20只。

1.2 实验试剂及仪器

血清骨碱性磷酸酶(BALP)试剂盒(上海碧云天生物),irisin酶联免疫吸附测定试剂盒(上海江莱生物科技有限公司),实时荧光定量 PCR 检测试剂盒、Trizol裂解液、反转录试剂盒(TAKARA 公司); CM-1000A-5702R 型低速离心机;小动物骨骼强度仪(安徽正华生物仪器设备有限公司);双能X骨密度检测仪(佰泰科技有限公司)。

1.3 模型制备

雌性成年大鼠麻醉采用水合氯醛,0.35mL/100g,腹腔注射。麻醉成功后,将大鼠固定,切开皮肤、肌肉,暴露腹腔,在肾脏下约1cm处见到输卵管和卵巢,先结扎摘除一侧卵巢,再行对侧卵巢切除,完整摘除后缝合切口。假手术组只摘除少许脂肪组织,其余同手术组。手术当天结束后每只动物皮下注射青霉素抗感染,术后禁食6小时。饲养于SPF级环境中3个月。三个月后测量大鼠腰椎及股骨的骨密度,并和术前的骨密度值比较,去势前后BMD差异是否具有统计学意义,以确定骨质疏松大鼠模型建立。

1.4 干预方法

空白组:正常SD大鼠,喂饲标准饲料,单笼喂养,不做任何治疗;模型组(PMOP模型):行双侧卵巢摘除术造大鼠骨质疏松症模型,喂饲标准饲料,单笼喂养,不做任何治疗;假手术组:SD大鼠只切除少量肠系膜,保留卵巢,喂饲标准饲料,单笼喂养,不做任何治疗;运动组(PMOP模型+运动4周):大鼠造模成功后,进行运动训练,训练方式:20m/min×1h,5°向上坡度,训练5天,随后休息2天,连续运动4周。模型+irisin注射组:行双侧卵巢摘除术造大鼠骨质疏松症模型,每天一次irisin肌肉注射,每次100 μg/kg,注射4周;每周注射5天,休息2天,在最后一次注射后24小时处死所有大鼠。

1.5 标本采集与检测

①腰椎和股骨骨密度(BMD):采用双能X线骨密度仪测定;②血清irisin、Runx2及OPG指标检测:采用ELISA法检测大鼠血清中irisin、Runx2及OPG;③ALP、Runx2、OPG蛋白活性测定:对各组股骨下段行测定采用免疫组织化学染色法,光学显微镜下观察ALP、Runx2及OPG蛋白表达水平。采用Image-pro plus 6.0软件读取IOD值进行定量分析;④Rt-PCR检测成骨分化调控因子Runx2及成骨活性的特异性标志物OPG的基因表达;⑤骨髓间充质干细胞(BMSCs):处死大鼠后, 分离大鼠股骨及胫骨,用完全培养液冲洗骨髓腔,同时收集冲洗液。高转速离心获取细胞沉淀液,置于5%CO2培养箱内,传代培养。第14 d时,将融合生长的细胞以2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。当进行第3～4代细胞传代时,计算得出BMSCs表达量[7]。用ELISA法检测OC和PINP含量。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 干预后各组大鼠骨密度比较

模型组腰椎、股骨BMD水平低于空白组和假手术组(P<0.05);空白组和假手术组腰椎、股骨BMD水平无统计学差异(P>0.05)。连续干预4周后,与模型组相比,运动组和模型+irisin注射组腰椎及股骨BMD 均有所提高(P<0.05)。详见表1。

表1 干预后各组大鼠骨密度比较

2.2 干预后各组大鼠血清irisin、Runx2及OPG比较

模型组大鼠血清irisin、Runx2、OPG含量低于空白组和假手术组(P<0.05)。运动组和模型+irisin注射组大鼠血清irisin、Runx2、OPG含量均高于模型组(P<0.05)。运动组和模型+irisin注射组大鼠血清irisin、Runx2、OPG含量无统计学差异(P>0.05)。详见表2。

表2 干预后各组大鼠血清irisin、Runx2及OPG比较

2.3 干预后各组大鼠ALP、Runx2及OPG蛋白表达情况

与空白组和假手术组相比,模型组ALP、Runx2、OPG蛋白表达有所降低(P<0.05)。运动组和模型+irisin注射组大鼠ALP、Runx2、OPG蛋白表达均高于模型组(P<0.05)。运动组和模型+irisin注射组大鼠ALP、Runx2、OPG蛋白表达无统计学差异(P>0.05)。详见表3。

表3 干预后各组大鼠ALP、Runx2及OPG蛋白表达

2.4 干预后各组大鼠Runx2、OPG的基因表达情况

与空白组和假手术组相比,模型组Runx2、OPG mRNA表达水平均降低(P<0.05)。运动组和模型+irisin注射组大鼠Runx2、OPG mRNA表达水平均高于模型组(P<0.05)。运动组和模型+irisin注射组大鼠Runx2、OPG mRNA表达水平无统计学差异(P>0.05)。详见表4。

表4 干预后各组大鼠Runx2、OPG mRNA表达

2.5 干预后各组大鼠BMSCs中IC增殖作用情况

与空白组和假手术组相比,模型组BMSCs中OC和PINP有所降低(P<0.05); 运动组和模型+鸢尾素注射组大鼠OC和PINP含量均提高(P<0.05), 运动组和模型+irisin注射组大鼠OC和PINP含量无统计学差异(P>0.05)。详见表5。

表5 干预后各组大鼠OC、PINP含量比较

3 讨论

Bruce等研究发现irisin是一种新的肌肉因子[3]。作为骨骼肌的使者,irisin传递骨骼肌的信号,沟通骨骼肌与外周组织的关系,因而被称为“运动激素”。研究显示,irisin能促进Runx2的表达[8],而Runx2是成骨分化的调控因子。OPG是调节骨代谢的关键因子,成骨细胞分泌OPG,与RANK竞争性地结合RANKL,抑制破骨前体细胞的分化成熟,以此降低破骨细胞活性,促使骨吸收与骨形成间形成平衡。ALP活性的高低是BMSCs成骨细胞分化的重要指标。BMSCs是骨髓基质重要组成成分,在不同诱导条件下,能够向成骨细胞、脂肪细胞等不同的细胞系分化,是人体内成骨分化和骨形成的重要细胞来源[9]。

本研究结果显示,模型组大鼠BMD、irisin、Runx2、OPG、BMSCs、ALP蛋白水平含量均低于其他4组。干预后, 运动组和模型+irisin注射组大鼠BMD、irisin、Runx2、OPG、BMSCs、ALP 蛋白水平与模型组相比有所提高,推测运动可能通过irisin增加ALP活性,促进BMSCs增殖,上调Runx2、OPG mRNA表达,对成骨及破骨双重调节,进而达到防治骨质疏松的目的。

综上所述,本研究发现运动能通过调节irisin含量,直接或间接影响影响骨量的表达;而irisin能提高成骨细胞分化活性,促进去卵巢大鼠BMSCs定向分化,进而提高骨密度,防治和延缓绝经后骨质疏松症的发生,应用irisin可能是临床上改善患者骨质疏松的一种潜在的治疗手段。