冒烟型多发性骨髓瘤的生物学特征研究

徐嘉轩 董晓庆 陈兵

冒烟型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma, SMM)是一种介于意义未明的单克隆免疫球蛋白血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS)和活动性多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)间的无症状恶性克隆性浆细胞疾病[1]。国际骨髓瘤工作组(IMWG)将真正的惰性骨髓瘤定义为SMM,其诊断标准为血清M蛋白≥3 g/dL或24 h尿本周蛋白≥500 mg,和(或)骨髓克隆浆细胞比例为10%～60%,且无骨髓瘤定义事件或淀粉样变[2]。SMM病人是一类高风险亚群,其进展为活动性MM的比例较高且不均匀,诊断后前5年内进展风险约为每年10%[3-4]。梅奥诊所提出的风险分层表明,SMM可根据骨髓浆细胞比例、M蛋白及血清游离轻链比值划分出低、中、高三类风险等级,其中位进展时间分别为110、68、29个月[5]。

目前SMM进展风险与疾病相关的临床指标有关[6],因此通常能够识别出小部分将要或者已经进展为MM阶段的病人。但由于MM生物学的高度异质性,仅靠现有的疾病临床因素鉴别出进展倾向或高危病人仍然不够全面和准确,因此深入阐明SMM内在的生物学特性尤为必要。基因芯片、下一代测序(next-generation sequencing, NGS)和单细胞测序等技术的应用为识别SMM基因组学及免疫学特征提供了平台支撑[7-8],有助于揭示骨髓瘤的克隆进化模式和进展分子机制,为临床评估SMM的进展风险提供更全面的手段。

1 细胞遗传学

细胞遗传学异常是SMM进展风险升高的重要因素,免疫球蛋白荧光原位杂交(FISH)作为染色体异常的常用临床检测技术,用以明确SMM病人中细胞遗传学异常的分布特点及其对进展预后的影响。Lopez-Corral等[9]的研究表明,SMM发生del 13q的比例(61%)低于MM(74%),高于MGUS(37%),发生t(11;14)、t(4;14)、t(14;16)、del 17p以及gain 1q等事件的比例也均介于MGUS与MM之间,且差异均具有统计学意义。这证实了骨髓瘤疾病进程中涉及到明显的遗传学异常浆细胞的克隆扩增,SMM则处于MGUS至MM克隆演变的中间过渡态。Rajkumar等[10]对351例SMM病人进行FISH分析表明,36.2%的病人存在免疫球蛋白重链(IGH)易位,发生IGH易位的病人中最常见的为t(11;14)(57例),其次为t(4;14)(36例)。与t(11;14)病人相比,t(4;14)病人向MM进展的中位时间明显更短(28个月比55个月),诊断为SMM后的中位生存时间也较短(105个月比147个月)。另外,del 17p也与进展时间缩短显著相关,其与t(4;14)均被认为是SMM细胞遗传学高风险因素。

基于诊断为SMM时及进展为MM后的配对样本纵向分析则更能反映骨髓瘤进程中克隆演化及亚克隆的影响。Merz等[11]开展纵向队列FISH分析强调了t(4;14)、del 17p、del 8p、del 13q以及gain 1q与更高的进展风险显著相关,并且这些细胞遗传学异常作为主克隆而非亚克隆时对预后的影响更加明显,其作为亚克隆遗传学异常也同样具有预后意义,尤其在高危SMM中更为显著。另一项纵向研究观察到SMM进程中出现新的细胞遗传学事件如del 13q、del 17p以及t(14;16)[12],验证了疾病过程中的克隆进化,并强调了在SMM阶段实施FISH检测的重要性。

2 基因表达谱

由于SMM进展到MM的生物学过程非常复杂,目前未能明确用来区分MM各阶段的特异性生物标志物,进展过程中涉及的信号通路和分子机制也尚未被完全了解。基于基因表达谱的生物信息学分析能够描绘功能通路富集特点、鉴定转录因子调控网络及建立风险预测模型,从而加深对疾病特性基因层面的认知。

转录组通路网络分析表明,与正常样本相比,SMM的差异基因数目明显少于MM,提示SMM拥有较为惰性的生物学功能状态,MM所涉及的通路富集更为复杂[13]。SMM差异基因中包括MAFB和HIF1A这两个转录因子,前者与许多SMM进展相关基因存在互作关系;而进展后的MM差异基因网络中包含26个转录因子,提示MM比SMM拥有更复杂的转录调控特性。进一步的,差异基因功能富集分析表明,SMM拥有覆盖且超过MGUS涉及的基因本体(GO)富集结果,表明SMM存在着与MGUS相似的生物学特性而又演化出新的功能通路,其中SMM最显著的GO类别是主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类受体,其他还包括蛋白复合物结合、细胞因子结合、激酶结合和蛋白二聚化活动;而MM显著富集的GO类别则与SMM存在着较大差异,其主要包括RNA结合、酶结合和结构性DNA结合等。

经基因共表达网络鉴定及拷贝数变异分析验证后得到4个SMM特征性的转录因子标志物[14],分别是MYC相关因子X(MAX)、锌指蛋白148(ZNF148)、转录因子4(TCF4)和ZNF281。MAX是MYC转录调控有关的复合物,其在SMM进程中拷贝数变异下调,被认为是MM中的肿瘤抑制基因[15];ZNF148在从正常到MGUS再到SMM的进程中拷贝数变异和基因表达量均逐渐上升,可能作为SMM早期诊断的潜在标志物,其也是MM转录调控网络特征中的重要一员[13];模块富集分析结果提示,ZNF281在SMM中转录基因更加活跃,更有利于引起DNA突变从而促进骨髓瘤细胞的增殖及恶性演变,而TCF4则在MGUS驱动过程中更为活跃。这4个转录因子在SMM发展进程中具有很强的生物学相关性,后续可开展功能实验深入验证其在体内外的重要作用。

有研究表明,从惰性骨髓瘤到MM的转变过程中,炎症及细胞因子/趋化因子信号通路是最为显著的调控通路,进而根据B细胞/浆细胞介导的免疫过程相关基因鉴定出一个多基因评估模型,其能够准确区分SMM和症状性MM的进程状态,有助于在基因表达层面评估SMM病人的分子学特征[16]。此外,一个结合临床特征的四基因评分模型(GEP4)被用来预测SMM进展为症状性MM的风险概率[17]:GEP4模型高评分病人2年进展为MM的概率为85.7%;而GEP4模型低评分、基线M蛋白<3 g/dL和白蛋白≥3.5 g/dL所共同确定的低风险SMM群体2年进展为MM的概率仅为5.0%。

3 基因组测序

既往关于SMM的基因组特征及其向MM进化模式的研究甚少,尤其是进展为MM过程中全基因组突变谱的变化差异尚不清楚。近年来,NGS技术尤其是全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)的应用提供了对骨髓瘤基因组编码区突变景观的全面刻画[18],识别出各种关键的MM驱动事件及其产生的分子学演变模式,并能预估疾病进展过程中各类驱动因素出现的时间序列[19],从而显著提升了对骨髓瘤发生与进展基因组学层面的认知。

SMM基因组图谱与MM具有相似的遗传学组成,如突变位点和结构重排,也具有相似的突变密度和克隆异质性[20-21]。SMM基因组的复杂性相当高,其复杂性与疾病进展时间或演化频率似乎无关。短时间内进展的高危SMM病人其转化条件并不总是依赖额外突变或克隆选择的获得,而可能是在外部因素的驱动下凭借基因组的复杂性达到向MM转化的阈值,这种转化进展可能与获得性突变模式的改变有关,而非突变总负荷的积累增加[20,22]。

SMM进展过程中的主要特征是克隆稳定性,一些常见的染色体异常如del 13q、超二倍体及IGH易位等均是克隆性的;常见的驱动突变如KLHL6、TP53及MAX等大多数也是克隆性的,可能在疾病早期获得并驱动克隆拓展。对于亚克隆而言,SMM具有显著的亚克隆异质性,且在进展时容易受干扰,例如骨髓微环境中存在的强大选择压力能定义克隆结构,进而在亚克隆演化和疾病进展中发挥关键作用。少数体细胞拷贝数变异如del 1p和del 17p是亚克隆性的,MM常见驱动事件相关的单核苷酸变异主要也是亚克隆的,表明它们是在疾病进展的后期获得的[20-22]。

研究表明,在SMM诊断时,大部分的遗传改变异常已经发生,即大多数病人的基因组成很大程度上取决于SMM的诊断时间,因此基于SMM诊断时发现的生物标志物能够作为基因组预测因子,以区分易于进展的高风险SMM病人[21,23]。KRAS、NRAS及FAM46突变是显著的进展风险因素[21],尤其是KRAS突变与更短的进展时间显著相关[24-25]。KRAS突变影响着细胞周期进展从而促进克隆清除和MM转化,携带KRAS突变的SMM病人更适合被定义为过渡进程中的MM[24]。信号通路突变层面,MAPK通路及DNA修复通路相关基因的突变与SMM进展风险相关[21];而与初诊MM病人相比,高危SMM病人NF-κB通路基因突变频率较低[26]。值得注意的是,活化诱导的胞苷脱氨酶对早期亚临床阶段突变格局的形成起着重要作用,载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽(APOBEC)能够驱动SMM进程且其活性随着疾病进展而提升,APOBEC相关突变在SMM进展病人中显著富集并与更短的进展时间相关[20-21,24]。此外,MYC异位或扩增作为关键的基因组结构突变事件,是SMM进展的独立危险因素,对预测骨髓瘤进展具有重要价值[21,24,27]。

基于WGS技术对SMM进展前后配对样本的全基因组分析能够识别出不同的生物学进展模式,从而深刻揭示SMM恶性转化的生物学基础。Bolli等[20]提出SMM进展的两种不同模式,第一种是静态进展模型,疾病进展到MM时相同的亚克隆结构保留,进展仅反映了从积累足够的疾病负荷到出现临床症状所需的时间,进展时间通常小于1年;第二种是自发进化模型,SMM亚克隆组成在缺乏任何来自治疗的选择压力下发生了变化,反映了形成一个真正的新恶性克隆并进展到明显MM所需的时间,其中位进展时间比第一种模型更长。Oben等[28]也证明WGS技术可用于识别两种生物学特征截然不同的SMM实体,即稳定型和进展型,两者在骨髓瘤基因组事件如驱动基因突变、染色体多态性、拷贝数变异及典型APOBEC突变活性等方面存在显著的差异。稳定型病例高危遗传事件负担较低,临床病程呈惰性且进展慢,较晚发生或缺少骨髓瘤定义的基因组事件;而进展型病人则较早发生或有足够数量的上述事件,恶性潜能高且进展快。

4 免疫微环境

免疫微环境失调是骨髓瘤重要的生物学特性,骨髓微环境中的浆细胞外在因素在疾病进展和治疗效果中起着关键作用[29]。骨髓瘤的发生与发展密切依赖于恶性浆细胞与骨髓免疫环境细胞成分间的交互作用,引起骨质破坏和免疫系统受损等,进而促进疾病进程、复发和耐药产生[30]。通过免疫表达谱、单细胞测序及流式细胞术等能够鉴定SMM的免疫微环境特征,有助于识别出高进展风险的SMM病人并开发新的免疫靶向疗法。

Isola等[31]的研究表明,与MGUS和MM相比,SMM中细胞毒性相关基因的表达明显上调,其中部分细胞毒性分子与抑制性免疫检查点如淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制性基序结构域(TIGIT)等表达呈正相关,可能损害骨髓细胞毒性T细胞的效应功能以及削弱抗骨髓瘤的免疫反应。进一步地,基于免疫成分和激活标志物表达谱聚类分析得到4个不同的亚群,其中亚群2病人细胞毒性分子如GZMB、GNLY、IFNG等表达较高,提示耗竭的细胞毒性T细胞水平较高,这类SMM病人的无进展生存期显著更短。该研究发现的高危SMM病人存在部分抑制性免疫检查点如TIGIT和LAG3表达上调也得到了单细胞测序结果的支持[32],后续可深入评估其作为阻遏SMM进展的免疫治疗靶点的应用潜力。另一方面,配对基因表达分析表明,与活动性MM相比,SMM阶段某些肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员如CD137、TNFAIP3、TNFRSF14等表达水平高,且与病人更短的无进展生存期显著相关,提示促炎微环境的形成可能促进骨髓瘤的进展[31]。因此,细胞毒性T细胞衰竭和慢性炎症可能是SMM中免疫失调导致浆细胞恶性进化的部分机制解释。

此外,Paiva等[33]发现高危SMM病人较健康对照者,免疫状态轻度受损,1型T辅助细胞及γδT细胞数量显著更少,使用来那度胺治疗这些高危病人后,其功能性活性T淋巴细胞数量得到提升,NK细胞表型发生显著变化,表明治疗性免疫调节能通过激活受损的免疫系统以延缓SMM进展。Zavidij等[32]观察到SMM阶段即出现调节性T细胞的早期积累,随后GrK(+)记忆细胞毒性T细胞种群丧失,后者在小鼠模型骨髓瘤免疫监测中起关键作用;同时也观察到SMM期间IFN信号通路强度升高,暗示涉及IFN通路的复杂调控网络在高危SMM阶段可能已经存在,有望成为预防SMM进展的干预靶点。Fernandez等[34]对73例SMM病人骨髓标本利用蛋白组学、血清组学及T细胞受体测序的综合方式进行高维免疫分析,鉴定出3个稳定的免疫分类亚群,并明确了骨髓血浆多效蛋白和骨髓T细胞水平的差异是这些免疫类群间的重要区分因素,这更加证实了骨髓瘤细胞和免疫微环境间复杂的相互作用导致SMM最终进展的可能性。

5 结语

SMM的生物学特征复杂且多样,不仅取决于恶性浆细胞本身的基因组遗传学特征,也受细胞外在因素如免疫微环境的影响。借助各类基因学或免疫学技术能够深刻揭示SMM疾病的生物学特性,有助于根据所鉴定出的特征因素进一步开发并验证新的风险分层系统,从而精准预测SMM的进展风险并使高危病人从早期治疗中获益。