不同芍药品种茎叶总酚含量及抗氧化能力比较

陈友锋，佟宁宁，刘 燕*，刘政安*

(1. 花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室 / 国家花卉工程技术研究中心 / 城乡生态环境北京实验室 / 林木花卉遗传育种教育部重点实验室 / 北京林业大学园林学院，北京 100083；2. 中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室 / 国家植物园，北京 100093)

生物体内抗氧化体系失衡会引发氧化应激，产生大量自由基，造成机体损伤，这也是导致衰老、心血管疾病及癌症等多种疾病的重要因素[1—3]。抗氧化剂能够清除自由基并有效减少氧化应激，减少疾病的发生，目前已广泛应用于食品及化妆品等行业。来源于植物的天然抗氧化剂已逐渐成为研究热点[4—7]。

芍药Paeonialactiflora属芍药科芍药属宿根植物，品种繁多，花大色艳，是著名的观赏花卉[8]。此外，芍药也是重要的药用植物，包含多种生物活性物质，主要有苷类、萜类及黄酮类等化合物，具有抗炎、抗氧化、镇痛、抗菌及对抗急性心肌缺血等多方面的作用[9—12]。芍药主要以根入药，关于芍药根系的化学成分和药理作用的研究已较为详尽[13—16]，而对于芍药茎、叶的该类研究相对较少。研究表明，芍药茎、叶也含有丰富的次生代谢物，具有较强的抗氧化能力，具备开发全新抗氧化剂的潜力[17]。迄今对芍药茎、叶抗氧化活性研究主要围绕单一品种不同发育时期抗氧化能力的动态变化展开[18]，而不同芍药品种茎、叶抗氧化活性的对比未见报道。

本研究以16 个芍药品种为对象，提取茎、叶酚类物质，测定总酚含量，利用DPPH、ABTS 和FRAP三种常用方法对体外抗氧化活性进行测定，使用APC 指数综合评价不同品种茎、叶的抗氧化能力，探讨不同芍药品种茎、叶总酚含量和抗氧化活性的差异，筛选具有较强抗氧化能力的品种，为芍药茎、叶的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试芍药16 个品种‘晴雯’‘仙鹤白’‘黑绣球’‘乌龙探海’‘紫绣球’‘桃花粉’‘垂头红’‘玉蝴蝶’‘百花紫’‘少女妆’‘巧玲’‘老来红’‘月照山河’‘兰重楼’‘种生红’‘陶然醉’均取自洛阳市农林科学院。于2021 年8 月选取5 年生以上，生长健壮，同一品种株高、冠幅、长势均一致的植株采集茎、叶。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：甲醇、乙醇、盐酸、醋酸和醋酸钠等为分析纯，均购买于国药集团化学试剂北京有限公司； 1,1- 二苯基-2- 苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridyl-S-triazine, TPTZ)、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS)购自美国Sigma-Aldrich 公司。

主要仪器：Scientz-48 型高通量组织研磨仪(中国宁波新芝生物公司)、DTX-880型多功能酶标仪(美国Thermo Fisher 公司)；Milli-Q 超纯水仪(美国Millipore 公司)；Heraeus Fresco 17 型高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher 公司)；KQ-300DE 型数控超声波清洗器(中国超声仪器公司)；精密电子天平(中国赛多利斯公司)。

1.3 方法

1.3.1 样品提取

将茎、叶样品置于65 ℃烘箱烘至恒重，用高通量组织研磨仪彻底粉碎，过60 目网筛。称取30 mg粉末，加入1 mL 70%甲醇，摇匀，浸泡4 h，40 ℃超声萃取20 min，12 000 r·min–1离心10 min，收集上清液，重复超声、离心过程，保证样品充分提取，将收集的上清液用0.22 μm 微孔滤膜过滤至离心管，用于总酚含量(Total polyphenol content，TPC)和抗氧化活性测定。

1.3.2 总酚含量和抗氧化活性测定

参照Wang 等[19]的方法测定总酚含量，在酶标仪上测定750 nm 处吸光度。DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力及铁离子还原能力FRAP(Ferric ion reducing antioxidant power)测定参照Wang 等[20]的方法，在酶标仪上分别测定515 nm、734 nm 和593 nm 处吸光度。

以没食子酸为参比物质，配制不同浓度梯度，与样品相同的反应条件，测定吸光值，作标准曲线(表1)，从而计算样品的总酚含量和抗氧化活性。

表1 芍药茎叶总酚与抗氧化活性标准品的线性响应Table 1 Linearity response for standards of total phenolic content and in vitro antioxidant activities in the stems and leaves of Paeonia lactiflora

1.3.3 抗氧化活性综合评价指数计算

为了全面系统地评价芍药茎、叶抗氧化活性，采用抗氧化活性综合(Antioxidant potency composite,APC)指数对DPPH、ABTS 和FRAP 三种方法进行综合评价[21]。某品种的APC 指数(%)为该品种的DPPH、ABTS、FRAP 值分别占全部品种中DPPH、ABTS、FRAP 最大值的百分比的平均值。

1.4 数据分析

利用SPSS 25.0 软件对数据进行单因素方差分析(One-Way analysis of variance, ANOVA)，用最小差异显著差法(Least significant difference, LSD)和Duncan’s 进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 芍药品种间总酚含量和抗氧化能力差异

由图1 可以看出，所选芍药品种叶的总酚含量为27.13～69.93 mg·g–1，平均为43.45 mg·g–1，品种间差异较大；茎的总酚含量为8.74～35.85 mg·g–1，平均为20.75 mg·g–1。叶的总酚含量显著高于茎，这与DPPH、ABTS、FRAP 三种方法测定的抗氧化活性结果高度一致(表2)。

图1 16 个芍药品种茎、叶总酚含量分布及范围Fig. 1 The distribution and range of total phenolic contents in stems and leaves of 16 cultivars of Paeonia lactiflora

表2 16 个芍药品种茎叶抗氧化活性Table 2 Antioxidant activities of stems and leaves of 16 cultivars of Paeonia lactiflora

DPPH 法测定结果显示，16 个芍药品种叶片的抗氧化活性平均达24.53 mg·g–1，而茎的抗氧化活性平均仅7.78 mg·g–1，二者差异显著，叶片远高于茎(表2)。在所有茎样品中，品种‘少女妆’和‘巧玲’的抗氧化活性最强，均为12.22 mg·g–1，‘桃花粉’活性最低，为3.04 mg·g–1，差异显著(P<0.05)。在所有叶片样品中，‘巧玲’的抗氧化活性最强，为46.53 mg·g–1，‘桃花粉’活性最低，为10.39 mg·g–1，差异显著(P<0.05)，结果与茎样品相似。

ABTS 法测定结果同样显示，叶的抗氧化活性远高于茎。其中，叶的抗氧化活性平均为51.19 mg·g–1，为茎的2.00 倍，茎的抗氧化活性平均为25.59 mg·g–1(表2)。在所有茎样品中，‘乌龙探海’和‘垂头红’的抗氧化活性较强，分别为 55.22 mg·g–1和55.19 mg·g–1，‘晴雯’活性最低，为8.06 mg·g–1，其他品种的样品活性集中在10.00～48.00 mg·g–1之间。在所有叶片样品中，‘巧玲’的抗氧化活性最强，为102.80 mg·g–1，‘月照山河’活性最低，为18.46 mg·g–1，差异显著(P<0.05)。

FRAP 测定结果与前两个方法类似，16 个芍药品种叶片的抗氧化活性远高于茎，其中，叶的抗氧化活性平均为13.68 mg·g–1，为茎的3.54 倍，茎的抗氧化活性平均为3.86 mg·g–1(表2)。但FRAP 得到的结果显示茎、叶抗氧化活性品种间差异不大，茎的抗氧化活性集中于3.00～4.70 mg·g–1；叶的抗氧化活性集中于10.00～17.00 mg·g–1。

2.2 芍药品种抗氧化能力综合评价

16 个芍药品种的抗氧化活性综合评价显示，茎抗氧化能力较强的品种为‘少女妆’‘巧玲’‘老来红’(APC 指数≥75.00%)(表3)，叶片抗氧化能力较强的品种为‘巧玲’‘少女妆’‘老来红’‘仙鹤白’(APC 指数≥75.00%)(表4)。

表3 16 个芍药品种茎的APC 指数Table 3 The APC index of the stems of 16 cultivars of Paeonia lactiflora

表4 16 个芍药品种叶的APC 指数Table 4 The APC index of the leaves of 16 cultivars of Paeonia lactiflora

2.3 芍药品种抗氧化能力相关性分析

对3 种方法测得的茎、叶抗氧化活性、APC 指数与总酚含量进行相关性分析。由图2 可以看出，16 个芍药品种茎中DPPH、FRAP、ABTS 这3 种方法测得的抗氧化活性、APC 指数及总酚含量两两之间均呈显著相关(P<0.05)，相关系数≥0.68(图2a)；叶中结果相似(P<0.05)，相关系数≥0.78(图2b)。

图2 16 个芍药品种茎(a)、叶(b)总酚含量与抗氧化活性的相关性分析Fig. 2 Correlation analysis of total phenolic contents and antioxidant activities in stems (a) and leaves (b) of 16 cultivars of Paeonica laticflora

3 结论与讨论

体外抗氧化活性测定具备操作简单、速度快及成本低等优点，目前已被广泛用作植物提取物的初步评估[22]。不同的抗氧化物作用机理有所差异，依靠单一的测定方法并不能完全反映其抗氧化活性强弱，因此需要结合多种检测方法评估抗氧化能力。本研究采用DPPH、ABTS 和FRAP 三种方法对不同芍药品种茎、叶的体外抗氧化活性进行测定，同时将3 种方法结合起来，采用APC 指数进行综合评价。结果表明，3 种方法测得的16 个芍药品种茎、叶抗氧化活性强弱大致相同，且与APC 指数大小顺序基本一致。相关性分析进一步显示，DPPH、ABTS、FRAP 方法测定的抗氧化活性以及APC 指数两两之间均呈显著相关。

有研究表明，多酚类物质具有较强的清除自由基与还原金属离子的能力，抗氧化能力极强[23—24]。本研究发现芍药茎与叶的总酚含量、抗氧化活性及APC 指数均呈显著相关(r≥0.68)，说明酚类物质是芍药茎叶抗氧化活性的物质基础，后续研究可关注调控酚类物质代谢的关键基因，开发新的抗氧化剂。

《中华人民共和国药典(2020 年版)》收录的芍药属植物中药材均为其根系，包括牡丹皮、赤芍和白芍等[25]。本研究中，16 个芍药品种叶的总酚含量平均为43.45 mg·g–1，显著高于赤芍(31.48 mg·g–1)、白芍(21.38 mg·g–1)、牡丹根(22.37 mg·g–1)的总酚含量[26]，而芍药茎的总酚含量(平均为20.75 mg·g–1)低于以上三者。此外，16 个芍药品种叶的抗氧化能力远高于茎，这与Tong 等[18]对芍药的研究结果一致，证实芍药叶片具有极强的抗氧化能力。

综上所述，芍药叶片具有良好的体外抗氧化活性，其物质基础为酚类物质，‘巧玲’‘少女妆’‘老来红’‘仙鹤白’这4 个芍药品种叶片抗氧化能力较强，可作为潜在天然抗氧化剂资源进一步开发利用。