利用Hoechst 33342-PI荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌生物活性的影响

贲海燕 霍建飞 姚玉荣 高苇 王万立 郝永娟 曲红云 张雪岩

摘要：本试验以茄病镰刀菌（Fusarium solani）为研究对象，探索了Hoechst 33342及PI荧光染剂对病菌不同活性孢子的色泽差异，明确了病原菌经Hoechst 33342染色后的活孢子发蓝色荧光，最佳染色浓度和时间为1ug／mL、20 min；碘化丙啶（PI）染色后的死孢子发红色荧光，最佳染色浓度和时间为3ug/mL、10 min。并由此建立了HoechsL 33342-PI荧光双染技术，应用该技术可快速、清晰地甄别出不同浓度氰氢化钙对茄病镰刀菌孢子活性和萌发的影响，结果表明，氰氨化钙对茄病镰刀菌的灭杀效果随着浓度增高而增强，且与处理时间呈正相关。2 000 mg/L氰氢化钙处理3h，孢子致死率高达83.97%；500-1000 mg/L处理3h，孢子致死率为7.15%-26.80%，孢子萌发率为2.40%～3.59%，处理48 h时，孢子致死率达92.07％～100%。250 mg/L氰氢化钙对茄病镰刀菌的致死效果微弱或没有影响。本研究通过菌丝速率法和生物量法进一步验证了应用Hoechst 33342-PI荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活力的影响是可行的。这为突破植物病原微生物药剂室内常规筛选方法提供了新的思路和技术手段。

关键词：Hoechst 33342-PI荧光双染法；氰氢化钙；茄病镰刀菌；生物活性

中图分类号：S432.4+4 文献标识号：A 文章編号：1001-4942（2023）02-0127-08

氰氨化钙作为农用化学肥料，已有100余年的使用历史，我国在20世纪60年代主要将其用作氮肥。21世纪初期，大量田间数据显示氰氨化钙还是一种高效、环境友好型的土壤消毒剂，能有效防治芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassLcae）、尖孢镰刀菌（Fusariurn

oxysporun）等引起的多种土传病害，而关于茄病镰刀菌（F.solani）引起的瓜类作物病害防治的相关报道较少。Bourbos等通过田间试验表明，氰氨化钙能有效控制由茄病镰刀菌引起的黄瓜根腐病。

常规作用于微生物的药剂筛选主要建立在室内生物活性测定。荧光染色法是医学方面检测细胞凋亡和细胞坏死的重要手段。细胞凋亡的主要形态特征是细胞体积缩小、孢浆凝缩而不外漏，核染色质固缩：而细胞坏死的主要形态特征是细胞肿胀，体积增大，或DNA降解，细胞破裂，胞浆外漏等。根据这些特征，选择适合的荧光染料，可以准确判断细胞的活力状态。植物病原微生物细胞凋亡的表型和生理特征与动物细胞相似，而且细胞结构和代谢过程更为简单。目前，荧光染色法在植物微生物研究方面仅有少数报道。

本试验以茄病镰刀菌为研究对象，根据Hoechst 33342、碘化丙啶（propidine iodide，PI）荧光染剂对生物细胞活性的不同作用效果，研发快速甄别病原菌死活的荧光染色技术。并基于该技术检测氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活性的影响，旨在创建快速、准确、灵敏的活性检测方法，为植物病原微生物药剂筛选的有效性提供新的思路和检测技术手段。同时，依据药剂筛选常用的室内生物活性测定法，如菌落生长、菌丝生物量、孢子萌发等指标，设计测定了氰氨化钙对茄病镰刀菌的抑制效果，为进一步开展氰氨化钙防治由茄病镰刀菌引起的作物病害提供理论依据。

1材料与方法

1.1供试材料

供试菌株：茄病镰刀菌瓜类专化型（Fusanum solani f.sp.cucurbitae），由中国农业科学院蔬菜花卉研究所菜病综防组鉴定保存（菌株编号：HC0903150102）。

供试药剂：氰氨化钙（calcium cyanamide，CaCN2），直径1-6 mm黑色粉末状，氰氨化钙含量50%，氮含量20％，钙含量38%，由宁夏大荣实业集团有限公司提供。

供试试剂：NaCL、KCL、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4、丙酮、冰醋酸、松柏油等均购自北京化工厂有限责任公司。

仪器设备：HQ-60型旋涡混合器（北京北方同正生物技术发展有限公司）：3K15型高速离心机（德国Sigma公司）；UV-1801型紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）；DP72型奥林巴斯荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）；XMTD-700水浴锅（江苏省金坛市汉康电子有限公司）。

荧光染料：Hoechst 33342、碘化丙啶（propidine iodide，Pl），购于Sigma公司。

1.2荧光染液配制

PBS缓冲液配制：K0 0.20 g/L，NaCl 8.00 g/L，NaH2P04 0.20g/L，Na2HPO4·12H2O 2.89 g/L，pH 7.4。

Hoechst 33342染液配制：称取0.001 g Hoechst 33342，加入10 mL 0.01 mol/L PBS（ pH 7.4）缓冲液，配成100 ug/mL的母液，4℃避光保存。使用前用PBS（pH 7.4）将其稀释成所需浓度。

碘化丙啶（PI）染液配制：称取0.001 g PI，加入10 mL 0.01 mol/L的PBS（pH7.4）缓冲液，配成100 ug/mL的母液，4℃避光保存。使用前用PBS（pH 7.4）将其稀释成所需浓度。

1.3茄病镰刀菌孢子悬浮液的制备

在250 mL PD培养基中接种茄病镰刀菌菌饼，26℃、150 r/min振荡培养4d，获得分生孢子培养液，将培养液经灭菌4层纱布过滤，收集滤液经5 000 r/min离心5 min，弃上清液，用无菌水重悬制成1x10个/mL孢子悬液备用。

1.4茄病镰刀菌无活力孢子的制备

茄病镰刀菌孢子致死处理采用恒温水浴热处理法，取1 mL新鲜孢子悬浮液于100℃沸水浴条件下热处理10 min致死。

1.5荧光染料对茄病镰刀菌染色效果评价

取新配制的有活力和无活力的茄病镰刀菌孢子悬浮液各1 mL，5 000 r/min离心5 min，弃上清：将Hoechst 33342和Pl母液分别稀释至3ug/mL后各取500 uL，重悬沉淀使孢子浓度为2x10个/mL;室温下避光静置染色20 min，分别吸取10 uL孢子染液于载玻片上，加盖玻片后在荧光显微镜下观察拍照，记录各荧光染料孵育下死活孢子的染色特征。

1.6荧光双染法对茄病镰刀菌染色效果评价

Hoechst 33342-PI双染法：取新配制的有活力和无活力的茄病镰刀菌孢子悬浮液各1 mL，混匀后经5 000 r/min离心5min，向孢子沉淀中加入500 uL浓度为1 ug/ml Hoechst 33342染液，常温避光孵育5 min后，加入500 ul浓度为1ug/mL的PI染液，常温避光染色5 min，吸取10 uL孢子染液于载玻片上，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.7Hoechst 33342和Pl最佳染色浓度及染色时间筛选

取新鲜有活力、浓度为1x10个/mL茄病镰刀菌孢子悬浮液1 mL，5 000 r/min离心5 min，弃上清，分别重悬于浓度为1、3、6、9 ug/mL的染料500 uL，使孢悬液浓度为2x10个/mL。每个浓度分别染色5、10、15、20 min，每個处理重复3次。于20倍荧光显微镜下，每个处理观察3个视野，每个视野不少于100个孢子，观察并记录孢子的染色效果并计算死亡率。

1.8氰氨化钙对茄病镰刀菌室内生物活性的测定

1.8.1基于Hoechst 33342-PI双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活力的影响 将斜面保存的茄病镰刀菌菌株进行活化，PDA平板上黑暗培养7天后，配制成有活力的茄病镰刀菌孢子悬浮液（1x10个/mL）分装到离心管中，每管10 mL备用；分别称取氰氨化钙0、0.005、0.01、0.02、0.04 g溶解于上述孢子悬浮液中，配制成氰氨化钙浓度分别为0、500、1 000、2 000、4 000 ug/mL的孢子悬浮混合液，每个浓度3次重复。分别在药剂处理0、10 min和3、9、48、72 h后，按1.7中的Hoechst 33342-PI双染法进行染色，在20倍荧光显微镜下，依据孢子荧光颜色，记录死、活孢子总量，其中死孢子发红色荧光，活孢子发蓝色荧光，凋亡孢子（处于死活之间）发蓝粉色荧光。每个样本观察5个视野，每个视野内孢子数量不少于100个，用以下公式计算孢子死亡率和萌发率。式中：a为显微镜视野中发红色荧光孢子总数；b为显微镜视野中发蓝色荧光孢子总数：c为显微镜视野中发蓝色荧光且萌发的孢子总数。

1.8.2氰氢化钙对茄病镰刀茵菌落生长影响的研究 采用菌丝生长速率法测定。称取氰氨化钙0、0.002、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g分别溶解在20 mL 50-55℃的PDA培养基中，配制成0、100、250、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的含药培养基，充分混匀倒平板，待平板凝固后在平板中央接种茄病镰刀菌菌饼（直径5 mm），以不加氰氨化钙的PDA培养基接种茄病镰刀菌为对照。28℃黑暗培养，每隔48h测量一次菌落直径，用十字交叉法计算菌落平均直径，每处理3次重复。

抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）／（对照菌落直径-菌饼直径）×100。

1.8.3氰氨化钙对茄病镰刀茵菌丝生长量和产孢量影响的研究

称取不同剂量氰氨化钙加入PD培养液中，得到终浓度分别为0、100、250、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的100mL含药培养液。在培养5d的茄病镰刀菌菌落边缘打取5 mm菌饼，每瓶接种3个菌饼，每个处理3次重复，以不加氰氨化钙的培养液为对照。25℃、120 r/min振荡培养3d后，真空抽滤滤出菌丝，用灭菌水冲洗3次，除去菌饼，与事先烘干至恒重的滤纸一同置于80℃烘箱中烘干至恒重，称量菌丝干重：收集过滤孢子悬浮液，用血球计数板记录各处理的孢子浓度，明确氰氨化钙对茄病镰刀菌菌丝量和产孢量的影响。

1.9数据处理与分析

数据采用Microsoft Excel进行整理，采用sPss26.0对数据进行单因素ANOVA分析，P<0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1各荧光染料对茄病镰刀菌染色效果评价

新制备的茄病镰刀菌孢子悬浮液经Hoechst33342染色后，荧光显微镜下观察发现，有活力孢子均匀分散，发明亮的蓝色荧光（图1）。经热处理致死的孢子，在荧光显微视野下不发荧光，该方法仅能观察到有活力的孢子，不能检测死亡孢子。

新制备的茄病镰刀菌孢子悬浮液经普通显微镜观察无法区分死、活孢子（图2A）：而经PI染色，在荧光显微镜下观察，有活力的孢子不发荧光，死亡孢子发红色荧光（图2B）。经高温处理致死的孢子，在荧光显微镜下观察，细胞界限清晰，均匀分散，发出强烈的红色荧光。该方法只能观察到死孢子，不能检测有活力的孢子。

2.2荧光双染法对茄病镰刀菌染色效果评价

茄病镰刀菌死、活孢子混合悬浮液在普通显微镜下无法区分（图3A）：而经Hoechst 33342-PI双染后，在荧光显微镜下观察，有活力的孢子发蓝色荧光，死亡孢子发红色荧光，二者颜色反差强烈，且死亡孢子分散度较好，无聚集现象（图3B）。该方法可将死、活孢子在同一视野中区分开，Hoechst 33342-PI荧光双染可作为茄病镰刀菌孢子活力检测及评价的有效方法。

2.3Hoechst 33342-PI双染法最佳染色条件

荧光染料有一定毒性，浓度过高或是染色时间过长可能对孢子活性产生不利影响。本研究发现茄病镰刀菌孢子对Hoechst 33342和PI的敏感程度存在差异。

结果表明（表1），Hoechst 33342染液浓度1-3ug／mL对孢子的毒性较小，随着染色时间的延长孢子死亡率差异不显著，为0.51%-0.93%：染液浓度6 ug/mL在15 min时的死亡率显著增加，染色20 min的死亡率为2.60％；染液浓度为9ug/mL对孢子表现出明显的毒性，孢子死亡率显著增加，染色5 min时死亡率为12.07％，20 min时达22.01%。结合荧光显微镜观察，1 ug/mL染色效果明显，孢子边界清晰，较长时间染色效果更稳定，综合判定Hoechst 33342染液最佳浓度为1ug/mL，染色时间为20 min。

PI染液致死率与染液浓度和染色时间呈正相关（表1）。PI染液浓度1-3 ug/mL随着染色时间的增加，孢子死亡率差异不显著，其中染液浓度3 ug/mL染色10 min时染色清晰程度趋于稳定，死亡率为0.81%；染色浓度6 ug/mL的致死率增加明显，染色20 min的死亡率为5.21％；染液浓度9 ug/mL的死亡率高达19.57%-31.12%。综合分析，PI染液最佳浓度为3 ug/mL，染色时间为10 min，此时死孢子发出强烈的红色荧光，分散度较好。

2.4基于Hoechst 33342 -PI双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活力的影响

通过荧光显微镜能直观监测氰氨化钙不同浓度处理对茄病镰刀菌孢子死活和萌发的影响。结果表明，氰氨化钙对茄病镰刀菌的杀灭效果与其处理浓度和处理时间呈正相关（图4）。氰氨化钙处理10 min，各处理的孢子致死效果不明显，死亡率接近零；处理3h，氰氨化钙1 000 mg/L和2 000mg/L的孢子致死率分别为26.80%和83.97％．250mg／L和500 mg/L的孢子致死率仅为9.20%和7.15％：随着氰氨化钙处理时间的延长，死亡孢子逐渐增多，处理48 h时，氰氨化钙500-2 000mg/L时的孢子致死率高达92.07%-100%。250mg/L的致死效果微弱，处理72 h的孢子致死率仅为5.64％。

氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子萌发的抑制作用随着浓度和处理时间的增加而增强（图5）。处理10 min，1 000-2 000 mg/L对孢子萌发已表现一定的抑制作用，萌发率为3.15％-3.33%；处理3h，2 000 mg/L的孢子萌发率为零，500-1 000mg/L的孢子萌发率为2.40%-3.59%，与对照相比降低56.54％-70.94%；随着处理时间延长，氰氨化钙的抑菌作用进一步增强，处理48 h，1 000mg/L时的孢子萌发率为零，500 mg/L时的孢子萌发率降至2.84%，与对照相比降低60.50%：处理72 h，500 mg/L时的孢子萌发情况与48 h相当，趋于稳定。250 mg/L对孢子萌发几乎没有抑制作用，后期还有一定的促进作用，可能是低浓度氰氨化钙在毒性微弱的情况下，为茄病镰刀菌提供了氮源更有利于其萌发。

2.5氰氨化钙对茄病镰刀菌菌落生长的影响

在含有不同浓度氰氨化钙的PDA培养基上进行抑菌试验，结果表明除低浓度以外，氰氨化钙的抑菌效果随浓度的增加而增强，但随着处理天数的延长，抑菌效果逐渐减弱（表2）。低浓度氰氨化钙（100-500 mg/L）对茄病镰刀菌的生长有一定的促进作用，比对照处理生长速率快，这可能是由于低浓度氰氨化钙释放的有毒物质氰氨不足以对茄病镰刀菌产生毒性，反而其提供的氮源被茄病镰刀菌充分利用促其生长。培养2d时，氰氨化钙1000-3 000 mg/L的抑菌效果逐渐增强，抑菌率为48.26％-100％；培养5d抑菌作用减弱，1 000-2 500mg/L的抑菌率为4.88%-25.66%，可能是氰氨有毒物质分解完全，茄病镰刀菌恢复生长。3 000mg/L氰氨化钙为茄病镰刀菌菌丝生长致死浓度，抑菌率为100%。

2.6氰氨化钙对茄病镰刀菌菌丝生长量和产孢量的影响

由图6可知，100 mg/L氰氨化钙对茄病镰刀菌菌丝生长量没有抑制作用，与对照处理差异不显著，但其对病菌产孢抑制作用明显，产孢量与对照相比降低40.43%（图7）。随着氰氨化钙浓度增加，茄病镰刀菌的菌丝生长量和产孢量逐渐降低，3 000 mg/L抑菌作用最强，菌丝生长量和产孢量与对照相比分别降低85.00％和97.32%。

3讨论与结论

荧光染色技术已在医学、神经学、微生物学及遗传学等研究学科得到了广泛应用，然而该技术在农业生产以及食品安全领域的研究相对较少。不同荧光染料可对不同活性的细胞进行染色，因此，不同荧光染料合理的结合使用，可以达到检测细胞活性的目的。本试验采用Hoechst 33342和Pl荧光染料分别对茄病镰刀菌孢子的活力进行了荧光显微镜观察。其中荧光染料Hoechst 33342的染色机理是直接作用有活性细胞的DNA上，在荧光显微镜下孢子发蓝色荧光，无聚集现象。PI染色机理是对失去细胞膜完整性的死细胞进行染色，并发强烈的红色荧光，死细胞较多时会有少量聚集现象，但不影响观察计数。

以上两种荧光染料只能单纯鉴定茄病镰刀菌孢子的死或活，在同一显微视野下无法对样品中孢子死活区分开，在实践应用中存在限制。本试验对茄病镰刀菌孢子进行Hoechst 33342-PI荧光双染观察，发现其能很好的区分茄病镰刀菌孢子的死活，在荧光显微视野下，活孢子发蓝色荧光，死孢子发强烈的红色荧光，凋亡孢子（处于死活之间）发蓝粉色荧光。荧光染料是一种毒性试剂，浓度过高或是染色时间过长均会对生物细胞造成伤害，导致其死亡：染色时间过短或是浓度较低会影响染色效果，发出的荧光不强烈，这些因素均会干扰试验检测计数结果。为了更好地将Hoechst 33342-PI荧光双染法应用于茄病镰刀菌的检测以及药剂筛选等，本研究探索出其最佳染色技术参数，Hoechst 33342浓度在6ug/mL以上，染色超过10 min，对孢子表现出一定毒性作用，浓度1-3 ug/mL对孢子几乎没有毒性作用，且孢子发出明亮蓝色荧光，界限清晰。综合判定Hoechst 33342的最佳浓度为1 ug/mL，染色20min的效果最理想：Pl染料对孢子死活的影响较大，毒性更强，特别是浓度6 ug／mL以上表现出明显毒性，从清晰度、稳定性判断3 ug／mL为最佳浓度，染色10 min即能达到较好的染色效果。

通过孢子染色比较试验，可测定不同杀菌剂对病原菌的抑制作用。施竹凤等采用台盼蓝孢子染色方法，发现19种药剂对根肿病菌的致死效果差异明显，其中明迪、福帅得等药剂的致死率较高（55.99％～162.49%），且药剂处理时间越长孢子死亡率越高。杨玲玉等对真菌孢子进行碘化丙锭染色发现，常温条件下5 000 ug/mL壳聚糖对灰葡萄孢（BotrytLs cinerea）和扩展青霉（Penicillium， expansum，）孢子的质膜均有明显的破坏作用。本研究应用Hoechst 33342-PI荧光双染技术结合荧光显微镜，可快速、清晰、直观地观测到氰氨化钙对茄病镰刀菌的致死作用。试验结果表明，高浓度氰氨化钙（2 000 mg/L）处理3h，显微视野中大部分孢子呈红色荧光，致死率达83.97％，此时孢子几乎不萌发，说明高浓度氰氨化钙释放了大量的有毒氰氨，在短时间内就可对茄病镰刀菌孢子有致死作用。氰氨化钙500-1 000 mg／L的致死效果與处理时间呈正相关，随着处理时间延长，视野中发红色荧光的孢子增多，萌发孢子减少，处理48 h时的孢子致死率高达92.07％-100％。250 mg/L氟氨化钙对茄病镰刀菌的致死效果微弱。

室内生物测定技术是利用靶标生物等对药剂的反应来鉴别农药药效的一种手段。本试验通过菌丝生长速率法、生物量法进一步明确了氰氨化钙对茄病镰刀菌的抑制作用。测定结果显示，100-250 mg/L氰氨化钙对茄病镰刀菌有一定的促进作用。崔国庆等研究表明，100 mg/L氰氨化钙对尖孢镰刀菌（F.oxysporum，）有促进作用，250 mg/L的抑菌效果较微弱，而1 000 mg/L对尖孢镰刀菌的抑制率达到97.02%，与本试验结果一致。500-3 000 mg/L氰氨化钙对茄病镰刀菌的抑制效果增强，且随着处理时间延长致死率增高。本试验为拓宽氰氨化钙在植物病害防治中的作用提供了借鉴，有助于进一步指导氰氨化钙防治植物病害开展田间药效试验。