粮油中多种真菌毒素检测技术研究进展

李华英，闫文婧，李进春，龚 洋，何 瑞，李 莉

（四川省粮油科研所，四川 成都 610017）

0 引言

某些真菌生物在生长过程中会产生次生有毒代谢产物——真菌毒素，这类真菌毒素具有强毒性、极易污染粮食产品，对人体具有致癌、致畸、致突变等作用，常见的真菌毒素有黄曲霉毒素、镰刀菌毒素、链格孢霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素等[1]。经真菌毒素污染的粮油产品被人体摄入后，会严重损害人体健康，甚至危害生命，检测粮油中真菌毒素含量是监控其品质至关重要的手段和方式。综述了近年来真菌毒素检测技术研究进展，主要包括常规仪器分析法、免疫分析法、光谱分析法，对比各项技术存在的优势及缺陷，以期为真菌毒素污染的粮食安全问题提供一定的技术帮助。

1 真菌毒素常见种类及危害性

黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌等真菌代谢所产生，具有B1、B2、M1、M2、G1、G2等多种类型，发霉变质的粮油易受其污染，其中黄曲霉毒素B1作为目前已知致癌性最强的真菌毒素，具有极强的急性毒性和慢性毒性，短期内大量摄入对肝功能损伤严重，长期持续性摄入会紊乱多种器官和组织的正常运作功能，引发慢性肝损伤、诱发肝癌[2]。

赭曲霉毒素是由赭曲霉属和青霉属真菌代谢产生的有毒物质，其中赭曲霉毒素A 的毒性最强，具有肾毒性、肝毒性、胚胎毒性、致癌性、遗传毒性等，主要损害肾脏器官，引发尿路上皮癌、巴尔干肾病、肾癌等[3]。

镰刀菌毒素是由镰刀菌合成代谢产出的毒性物质，包括玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇。玉米赤霉烯酮会影响生物正常生长发育，具有生殖毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致癌性等，引发肿瘤疾病。脱氧雪腐镰刀菌烯醇，又称为呕吐毒素，具有免疫毒性、器官毒性、致畸性等，会引发呕吐、厌食、腹泻、血液病[4]。

2 粮油中真菌毒素检测技术及优缺点分析

2.1 常规仪器分析法

2.1.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法是目前使用较为广泛的真菌毒素定量测定方法，其基本原理为：选择合适的有机溶剂提取毒素，后经液液萃取、免疫亲和、固相萃取、凝胶色谱等技术进行净化，通过色谱柱时由于样品中各物质在流动相和固定相中的分配系数和亲和力不同，在固定相和流动相中连续交换实现分离与检测，常用的检测器包括荧光检测器、紫外检测器、二极管阵列检测器等[5]。Wang Weigang 等人[6]建立了复合免疫亲和柱-在线光化学衍生-高效液相色谱法，同时对谷物及其制品中黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2、M1、M2）、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素（A、B） 进行检测，在不同加标浓度下，9 种真菌毒素的回收率均大于80%，相对标准偏差为1.0%~5.6%，检测限为0.02~5.00 μg/kg，定量限为0.07~16.70 μg/kg。邵亮亮等人[7]建立了复合免疫亲和柱净化高效液相色谱法，同时测定小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A 4 种真菌毒素，4 种真菌毒素的回收率均大于85%，相对标准偏差均小于5.0%。高效液相色谱法可对真菌毒素同时进行定性和定量分析，灵敏度高、重现性好，色谱柱可重复利用，但前处理操作繁琐，对试验人员检测技术要求较高、设备昂贵、检测时间长，无法满足大批量样品的快速测定[8]。

2.1.2 液相色谱-质谱串联法

液相色谱-质谱串联法将液相色谱与质谱联合使用，液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，集中了液相色谱对复杂样品的高分离性能与质谱提供物质相对分子质量和结构信息两大优势，实现对多组分真菌毒素的定性与定量检测[9]。Zhao H 等人[10]建立了一种改进的QuEChERS 方法，结合优化的HPLC-MS/MS 法，同时分析植物油中16 种常见的真菌毒素，采用一步提取法对植物油中的真菌毒素进行提取，测得16 种真菌毒素的回收率为72.8%~105.8%，检出限为0.04~2.90 ng/mL。该方法相较传统的液相色谱法具有高分离性、高灵敏度、高特异性的特点，无需对样品进行衍生化处理便能够进行真菌毒素多重检测，但其检测成本较高、仪器设备操作较复杂，通常用于大型实验室的使用，暂不能满足现场检测的要求[11]。

2.1.3 气相色谱法

气相色谱法是利用不同物质沸点、极性及吸附性等方面的差异，对热稳定性较好和易挥发性物质实现分离，完成真菌毒素定性和定量的测定，常用的检测器有电子捕获检测器、氢火焰离子化检测器、火焰光度检测器等[12]。张正炜等人[13]采用气相色谱法检测小麦粉中呕吐毒素含量，小麦粉经乙腈/水混合溶液提取，通过衍生化处理，采用电子捕获检测器（ECD） 测定。呕吐毒素在0.01~1.0 mg/L 范围内线性关系良好，线性相关系数为0.998 5。在加标浓度为0.04~1.0 mg/kg 的添加水平下，平均回收率为93.8%~108.5%，相对标准偏差为4.3%~8.6%，检出限为0.01 mg/kg。气相色谱法可以检测不含荧光基团或发色基团、荧光或紫外光吸收较弱的真菌毒素，灵敏度高、特异性强、可以同时对样品中多组分真菌毒素进行测定。但该方法的衍生化处理过程复杂繁琐，检测成本高、耗时长，不适用衍生化试剂的真菌毒素无法进行气相色谱检测。

2.2 免疫分析法

2.2.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法能够快速检测真菌毒素，其检测原理为抗原与抗体特异性结合，在固相载体上包被抗原（或抗体），随后制备酶标抗体（或抗原），样品与酶标抗体（或抗原） 会进行竞争性结合，加入底物后由于酶的催化作用发生显色反应，显色深浅与被测抗原或抗原的浓度呈正比，包括直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法[14]。Pereira C S 等人[15]评估了黄曲霉毒素B1检测试剂盒的定量测试能力，结果表明，检出限为1.1 μg/kg，定量限为2.5 μg/kg，室内平均相对标准偏差的为9.3%，回收率达101.8%，所测数据符合制造商声明、符合GIPSA 关于该参数的所有要求。根据酶联免疫法制备试剂盒进行测定，灵敏性高、时间短、速度快、成本低、前处理简单、无需使用大型仪器，已广泛应用于真菌毒素的检测中，但该法仍存不足，受环境因素影响显著，试验结果重复性差，对试剂的选择性较高，化学结构相似的物质无法辨别，存在假阳性。

2.2.2 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法是通过胶体金标记抗原或抗体的免疫结合分析技术，免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、层析膜、吸水滤纸、PVC 板构成。检测原理为：胶体金作为标记物，硝酸纤维膜作为固相载体，通过毛细管作用和层析作用，结合标记物与游离标记物在层析膜上逐步分离，样品中的真菌毒素与金标试剂特异性结合形成免疫复合物被截留，并发生显色反应，显色深浅与真菌毒素的含量呈正比[16]。杜兵耀等人[17]采用胶体金免疫层析法检测谷物中黄曲霉毒素的含量，同时采用高效液相色谱法检测样品，比较验证胶体金免疫层析法可行性，相符率高达90%。该法试验操作及设备简单、体积小、易携带、即时可测、简便快捷、筛选量大，但由于胶体金纳米粒子稳定性较差、受温度影响大、无法长时间保存、颜色亮度较浅等问题，导致其存在检测灵敏度低、定量困难、结果不准确等缺点。

2.2.3 荧光定量免疫层析法

荧光定量免疫层析技术的原理为荧光标记物在特异性基团或亲和素-生物素的作用下与抗原、抗体进行特异性结合形成复合物追踪整个化学反应进程，进而对待测物进行定性定量分析，现今常见的荧光标记物有荧光素、量子点、量子点微球、时间分辨荧光微球等[18]。Li J 等人[19]采用量子点微球作为标记物能够在10 min 内快速检测黄曲霉毒素B1含量，检出限为0.005 ng/mL，相对标准偏差小于10%，回收率在78%~88%，其研究结果表明可用于谷物产品黄曲霉毒素B1的快速现场检测。该法虽起步较晚，但具有灵敏度高、检测时间短、定量精准、操作便捷、多种荧光标记物可供选择等优点，各方面均优于胶体金免疫层析技术，是目前的研究热点。

2.3 光谱分析法

2.3.1 近红外光谱

近红外光谱分析技术依靠于含氢基团振动倍频与合频的特征信息，近红外光照射使得样品的含氢基团受到刺激发生共振，近红外光的能量被部分吸收后形成近红外光谱图。真菌毒素中不同基团对近红外光有选择性吸收的效果，由此反应出有机化合物的组成和分子结构信息，从而对真菌毒素进行定性和定量分析[20]。蒋雪松等人[21]利用可见/近红外光谱在线检测系统采集小麦的光谱图，提取其特征波长后建立定量预测模型，基于LDA 和PLS-DA 2 种判别分析方法建立的定性分析模型建模集总体准确率分别为88.46%，89.23%，对未超标的样品能够准确识别，但无法进行可靠的定量预测。该法具有无需对样品进行前处理、无需消耗化学试剂、检测高效快捷等优点，在真菌毒素高污染的粮食中呈现较好的检测能力，但真菌毒素分子量小、含量低、分子振动信号弱，不适用于微量真菌毒素的检测[22]。

2.3.2 拉曼光谱法

拉曼光谱是将真菌毒素与入射光作用后的散射信号进行收集而形成的振动光谱。拉曼频移与真菌毒素分子的振动和转动能级有关，与入射光波长无关，具有特征性，由此可对分子结构表征、内部应力分布、成键效果等进行分析。杨雪倩等人[23]采用拉曼光谱法检测6 个不同霉变等级的玉米中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量，经过对光谱数据处理及有效特征波长的筛选构建BPNN 预测模型，黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮含量预测值的相关系数和均方根误差分别为0.986 9，0.098 7，0.967 3，0.092 2。对表面增强拉曼散射改善了传统拉曼光谱灵敏度低的缺点，具备快速、高效、低成本，同时满足多种真菌毒素测定等特点。但作为近年来的创新技术，存在机理尚未清晰、基底复现性差、“拉曼光谱指纹”数据库未完善等诸多问题。

3 结语

目前，真菌毒素的检测分析技术方法较多，但对于大批量样品的检测暂未探索出同时满足微量、高效、灵敏、快速、准确、低成本的检测方法。常规仪器分析法具有极高的准确性和灵敏性，但前处理繁琐、测试成本高、获取数据结果慢、对操作人员要求高。免疫分析法更适合大批量样品现场快速检测的需要，具有操作简单、灵敏度高、特异性强、成本低、快速等特点，但检测结果准确性具有局限性，存在假阴性、假阳性的干扰。光谱分析法在真菌毒素的检测领域具有广阔的应用前景，无需预处理、检测速度快、灵敏度高、可进行定性判别，但在认可度、稳定性和精密度方面存在不足，仍处于试验探索阶段。为了更好地满足粮油质量检验的需要，结合具体的生产生活需求，探索或选择粮油产业更为先进的真菌毒素检测手段，促进我国粮油产业的进步和发展。