马铃薯疮痂病不同抗性品种发病与健康块茎内生细菌群落结构及多样性

2023-08-27 07:58杨鑫赖振光樊吴静李丽淑何虎翼唐洲萍

江苏农业科学 2023年14期

杨鑫　赖振光　樊吴静　李丽淑　何虎翼　唐洲萍

摘要：采用Illumina Miseq测序技术对比分析马铃薯不同抗性品种发病与健康块茎内生细菌群落结构多样性和优势菌群的差异性。结果表明，病原菌侵染改变了内生细菌原有的群落结构组成和多样性特征，与健康块茎相比，易感病品种闽薯2号发病块茎内生细菌Shannon指数降低，独有OTU明显提高，抗病品种中薯566发病块茎内生细菌Shannon指数略有提高，独有OTU数量降低；不同品种发病和健康块茎门、属水平上的主要优势菌分别为变形菌门（Proteobacteria）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）；抗病品种块茎内生细菌多样性和有益微生物群落结构比易感病品种更丰富和稳定，闽薯2号发病块茎内慢生根瘤菌属、假单胞菌属（Pseudomonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）等有益菌群不同程度降低，而中薯566发病块茎有益微生物的相对丰度明显提高；放线菌属（Actinobacteria）是健康块茎的重要细菌类群，对拮抗内生菌的挖掘具有一定的指导意义。

关键词：马铃薯疮痂病；品种抗性；内生细菌；群体多样性；丰富度指数

中图分类号：S435.32文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）14-0134-07

冬作馬铃薯作为广西优势产业，种植历史悠久，随着马铃薯主粮化战略启动实施，种植区域逐步扩展，由于带菌种薯的转移和栽培管理不当导致马铃薯种植地均有疮痂病发生，并呈逐年加重趋势。马铃薯疮痂病是由疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）引起的一种土传性和种传性病害［1］，疮痂病链霉菌的腐生性使其能在低温生存，温度升高恢复致病力，使其难以根治［2］，它主要危害块茎表皮，在薯块上形成凹陷或凸起的疮痂状斑块，严重影响薯块的外观品质和经济价值。目前主要依赖药剂防治，虽取得一定成效，但也存在较大弊端，如农药残留、病原菌抗药性及植物微生态环境失衡等。“以菌治菌”的生物防治方法因具有高效性、低成本、环境友好等特点，逐渐成为马铃薯疮痂病防治的热点和趋势。

植物内生菌是指其生活史中的某一段时期生活在健康植物各组织器官的细胞间隙或者细胞内部，不引起宿主植株发生明显病害的一类微生物［3-4］。植物内生菌长期定殖于植物组织内部并与之长期协同进化形成了互利共生的关系［5］，内生菌与植物共同组成一个复杂微生态系统，使其具有丰富物种多样性和特殊生物功能，对调节宿主体内的微生态平衡以及促进宿主植物健康生长发挥重要作用，是一类具有巨大应用潜能的新型生防资源［6-7］。研究发现，植物内生菌的分布特征与其定殖宿主植物的种类或品种、部位以及生长的地理环境等因素紧密相关［8］。不同抗性品种内生菌群落结构组成相似，但多样性特征存在较大差异，内生菌对寄主选择偏好性可能与寄主自身的生理结构、营养代谢途径以及其分泌的次生代谢产物有关［9-10］。健康和感病植株内生菌存在明显差异，内生菌多样性、丰富度与植株健康水平密切相关，病原菌的入侵降低了植株对外源菌的选择性［11-12］。

马铃薯不同品种对疮痂病具有不同的抗性［13-15］，这种抗性是否与抗感品种的内生细菌有关，以及抗、感品种是否存在内生菌多样性和种群结构的差异。为了解释这个科学问题，本研究采用Illumina Miseq测序技术对马铃薯抗疮痂病品种和易感病品种、健康和发病块茎内生细菌的群落结构和多样性进行分析，探讨品种抗性与其内生细菌间存在的关系，旨为马铃薯内生细菌微生物信息系统构建、疮痂病拮抗菌的筛选和利用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料及病原菌

供试品种有费乌瑞它、紫云1号、云薯304、希森6号、闽薯2号、华薯9号、黔芋8号、中薯早39、中薯566，均为无疮痂病斑的原种一代，由中国农业科学院蔬菜研究所提供；供试病原菌株加利利疮痂链霉菌（Streptomyces galilaeus），由内蒙古大学马铃薯工程技术研究中心提供。

1.1.2 供试培养基

OMA培养基：20 g燕麦粉，煮沸20 min后，经过3层纱布过滤，18 g琼脂粉，混合后蒸馏水定容至1 000 mL，pH值调节到7.0。

1.1.3 主要试剂和仪器

细菌基因组提取试剂盒，购自OMEGA公司；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，购自AXYGEN公司；QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统，购自Promega公司；用PacBio构建文库和进行测序。

1.2 试验方法

1.2.1 不同抗性品种筛选

1.2.1.1 接种体的制备

供试菌株在燕麦培养基中28 ℃培养14 d，用无菌水冲洗菌株孢子并调节孢子悬浮液浓度为106 CFU/mL，采用平板稀释涂布法确定孢子浓度。

1.2.1.2 播种与管理

盆栽试验前先进行种薯催芽、薯块消毒以及土壤灭菌，土壤与基质按1 ∶1的比例混合后，在1×105 Pa条件下灭菌30 min；每盆种植1个薯块，每个品种重复4次，分别于播种、播种后4周灌根接种200 mL菌悬液，对照处理浇入等量清水。播种后30 d，根据植株的生长情况浇水，之后进入控水期，待植株出现缺水症状后再浇水以促进疮痂病的发生。田间试验采用单因素随机区组排列，试验地点为广西壮族自治区农业科学院里建科研基地，时间为2021年11月至2022年3月，每个品种设3次重复，小区面积为18 m2，单垄双行品字形的摆放方式播种，株行距为25 cm×40 cm，种植密度为4 500株/667 m2。

1.2.1.3 收获与病情调查

90 d后盆栽收获，将所有直径大于0.75 cm的块茎进行清洗，晾干后称质量，统计每个品种的发病率、病情指数，以及每个块茎的病斑面积及块茎表面深度最大的病斑深度。根据邢莹莹的病斑分类方法［14］计算每个植株中每一块茎的病斑面积等级（MA）、病斑深度等级（MD）、疮痂指数（scab indrx，SI），SI=（MA×MD）/20×100；根据每个处理疮痂指数的平均值（MSI），将各品种分为5个等级：高抗，0＜MSI≤6；中抗，6＜MSI≤15；感病，15＜MSI≤22；易感，22＜MSI≥30；高感，MSI＞30。马铃薯成熟期，测定整个小区大、小薯质量，折算商品薯率和产量。

1.2.2 高通量分析不同抗性品种内生菌的多样性

1.2.2.1 样品表面消毒

取健康和发病（平均每个薯块发病等级3级）马铃薯块茎，洗净表皮，每个品种取3个大小均匀的薯块，用1%吐温20浸泡 1 min，2.5%硫代硫酸钠浸泡10 min，无菌水冲洗3遍，取出后浸入10%无菌碳酸氢钠溶液中15 min以破坏表面结构，无菌水冲洗5次，最后1遍无菌水洗涤液涂板检测无菌说明表面消毒有效。用无菌打孔器（d=15 mm）从茎基部插入表面消毒好的薯块，取出样品，切成5 mm长小块，于超净工作台内自然风干，称取1 g于无菌研钵用液氮研磨成粉末，转至无菌离心管中。

1.2.2.2 基因组DNA提取及扩增测序

使用DNA提取试剂盒对样品进行总DNA提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA浓度和纯度。利用16S rRNA基因通用引物799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1193R（5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′）对V5～V6区域进行PCR扩增。PCR反应体系和反应条件参考刘晓静等的方法［15］。使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR产物，经Tris_HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行定量检测。

1.2.2.3 Illumina PE250文库构建、测序及数据处理

连接“Y”字形接头-使用磁珠筛选去除接头自连片段-利用PCR扩增进行文库模板的富集-氢氧化钠变形，产生单链DNA片段。文库构建后利用Illumina公司的Miseq PE250进行高通量测序。将有效序列按97%的相似性聚类成为操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），进行生物信息统计和物种分类学分析，计算样品多样性和优势物种丰度差异性。

2 结果与分析

2.1 品种抗性鉴定

本研究采用大田试验观察产量性状，盆栽接菌进行抗性鉴定。试验结果表明，空白对照盆栽未感病，说明基质不含有疮痂病病菌，灭菌彻底。由表1可知，全部材料的平均疮痂指数（MSI）在10.00～28.00之间，紫云1号、中薯566、希森6号、云薯304的MSI为10.00～13.33，表现为中抗品种；费乌瑞它、黔芋8号、华薯9号、中薯早39的MSI为 15.11～19.24，表现为感病品种；闽薯2号的MSI为28.00，表现为易感品种。通过抗性评价和产量性状可知，闽薯2号的疮痂指数显著高于中薯566，在中抗品种中，中薯566的产量表现最好，因此，选择中抗病品种中薯566和易感病品种闽薯2号开展下一步试验。

2.2 测序数据分析

以中抗病品种中薯566和易感病品种闽薯2号的健康、发病块茎为测序样品，原始数据经过优化处理后，处理A、B分别得到31 050、40 692条高质量序列片段，11 716 232、15 329 918个碱基，序列平均长度均为377 bp；处理C和处理D分别得到 47 864、43 344条高质量序列片段，18 047 225、16 364 743 个碱基，序列平均长度分别为377、378 bp（表2）。Specaccum物种累积曲线（图1）反映，随着样本量的增加曲线逐步趋向平缓，说明抽样充分，可满足样品间细菌群落结构的对比分析。

2.3 OTU聚类分析

在97%相似度水平上对样品序列进行OTU聚类，处理A鉴定得到细菌属8个门，10个纲，27个目，43个科，84个属，107个种，442个OTU；处理B鉴定得到细菌11个门，17个纲，41个目，64个科，134个属，172个种，493个OTU；处理C鉴定得到细菌9个门，14个纲，34个目，56个科，105个属，135个种，375个OTU；处理D鉴定得到细菌9个门，15个纲，33个目，60个科，125个属，163个种，476个OTU（表2）。结果表明，发病块茎OTU总量比健康块茎低，中薯566发病和健康块茎OTU总量均比闽薯2号少；与闽薯2号相比，中薯566发病后块茎OTU总量明显降低。

Venn图能直观展示不同样本中共有和独有的OTU（图2），在属和OTU水平下，4个样本块茎内生细菌共有337个OTU，主要属包括慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、中慢生根瘤菌属（Mesonrhizobium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、叶杆菌属（Phyllobacterium）、嗜甲基菌属（Methylophilus）、沙雷氏菌属（Serratia）等；处理A和处理B共有440个OTU，处理A和处理C共有447个OTU，处理C和处理D共有488个OTU，处理B和处理D共有530个OTU。处理A独有OTU个数为348，主要有变形杆菌属（Proteobacteria）、香味菌属（Myroides）、根瘤菌属（Allorhizobium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、鞘脂杆菌属（Sphingobacterium），鞘氨醇杆菌属（Chitinophaga）、根瘤菌属（Allorhizobium）、新鞘酯菌属（Novosphingobium）等；处理B独有的OTU个数为82，主要属包括伯克氏菌属（Burkholderia）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、原小单胞菌属（Promicromonospora）、不黏柄菌属（Asticcacaulis）、细链孢菌属（Catenulispora）等；处理C独有的OTU个数为56，主要属包括Herminiimonas、黄杆菌属（Flavobacterium）、根瘤菌属、拟杆菌属（Bacteroides）、赖氏菌属（Leifsonia）等；处理D独有的OTU个数为68，主要属包括玫瑰单胞菌属（Roseomonas）、根瘤菌属、气微菌属（Aeromicrobium）、耐重金属中慢生根瘤菌（Alsobacter）、类诺卡氏属（Actinoplanes）等。结果表明，不同抗性品种健康块茎共有的OTU数量比发病块茎多；闽薯2号发病块茎独有OTU数量比健康块茎明显提高，中薯566发病块茎独有OTU数量比健康块茎少。

2.4 内生菌α多样性分析

α多样性可以反映微生物群落的丰度和多样性。Chao、Richness指数反映样品细菌群落物种的丰富度；Shannon、Simpson指数代表细菌群落多样性；ACE、Evenness指数表示样品细菌群落均匀度。其中，Simpson指数越大，说明群落多样性越低，其余指数值越大，说明相应的群落丰富度、多样性和均匀度越高。

由表3可知，各处理样品测序深度均达到0.99，表明测序结果合理。处理B和处理D的丰富度指数Chao、Richness分别比处理A和处理C高，处理A的多样性指数Shannon比处理B低，处理C的多样性指数Shannon比处理D高。由此可知，不同抗性品种发病块茎内生细菌丰富度比健康块茎降低，闽薯2号发病块茎内生细菌多样性指数降低，中薯566发病块茎内生细菌多样性比健康块茎有所提高。

2.5 内生菌群落组成和结构分析

分别对4组样品门、纲、目、科、属水平的群落结构进行分析。由图3可知，不同样品内生细菌共鉴定出5个门类，依次为变形菌门（Proteobacteria，73%～93%）、放线菌门（Actinobacteriota，3%～17%）、拟杆菌门（Bacteroidota，4%～12%）、厚壁菌门（Firmicutes，1%～2%），其他占1%左右。不同抗性品种内生细菌群落门水平上的组成相似，但丰度占比不同：处理A变形菌门占比最大，为93%，分别比处理B和处理C提高了27.40%和16.25%；放线菌门在处理B中占比最大，为17%，处理A放线菌门相对丰度比处理B降低了82.35%；拟杆菌门在处理C中占比最大，为12%，比处理D提高了200%。

由图4可知，属水平上，可归类的微生物群落有慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、生根根瘤菌属（Mesorhizobium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）、叶杆菌属（Phyllobacterium）、金黄杆菌属（Phyllobacterium）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、沙雷氏菌属（Serratia）等30个菌属。不同处理主要的优势菌属均为慢生根瘤菌属，优势菌属组成、相对丰度与品种抗性、健康程度不同而有所差异。处理A的优势菌属主要有慢生根瘤菌属（17.91%）、沙雷氏菌属（12.49%）、生根根瘤菌属（12.27%）、叶杆菌属（5.40%）；处理B主要菌属有慢生根瘤菌属（20.04%）、假单胞菌属（14.25%）、原小单胞菌属（Promicromonospora，9.42%）、黄杆菌属（5.95%）；处理C主要菌属有慢生根瘤菌属（11.77%）、黄杆菌属（11.16%）、嗜甲基菌属（Methylophilus，10.77%）、假单胞菌属（9.70%）、生根根瘤菌属（8.97%）；处理D主要菌属为慢生根瘤菌属（36.80%）、生根根瘤菌属（16.68%）、叶杆菌属（11.13%）、金黄杆菌属（Chryseobacterium，4.83%）、红假单胞菌属（4.67%）。处理A慢生根瘤菌属占比比处理B降低2.13%，处理C慢生根瘤菌属、生根根瘤菌属占比分别比处理D降低25.03%、7.71%；处理A假单胞菌属、黄杆菌属占比分别比处理B降低了12.25%、3.77%，而处理C假单胞菌属、黄杆菌属占比分别是处理D的6.9、25.5倍；处理A的沙雷氏菌属相对丰度比处理B明显提高。

2.6 组间内生菌优势物种差异分析

利用LEfSe分析方法进行病健马铃薯块茎内生菌差异显著性分析。图5-A为聚类树，图5-B是通过线性判别分析（LDA）分析2个组别当中有显著作用的微生物类群获得的LDA分值图。由 LDA值分布可知，B组物种丰度最高，为物种差异组。放线菌门（Actinobacteriota）、放线菌纲（Actinobacteria）、Thermoleophilia、微球菌目（Micrococcales）、假诺卡式目（Pseudonocardiales）、丙酸杆菌目（Propinibacteriales）、原小单胞菌属（Promicromonosporaceae）、假诺卡式属（Pseudonocardiaceae）以及厚壁菌门（Firmicutes）芽孢杆菌纲（Bacilli）芽孢杆菌目（Bacillales）芽孢杆菌属（Bacillus）均是B组中起重要作用的微生物类群，其中放线菌属（Actinobacteria）对其影响程度最大。结合进化分支图（图5-A）可知，变形菌门（Proteobacteria）、丙型变型菌纲（Gammaproteobacteria）、伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）、Xenophilus是A组中的差异微生物类群；放线菌门（Actinobacteriota）、放线菌纲（Actinobacteria）、微球菌目（Micrococcales）、微球菌科（Micrococcaceae）是D组中的差异微生物类群。

3 讨论与结论

植物內生菌广泛分布在植物体内，种类繁多，具有丰富的种群生物多样性，其种类组成及结构变化受到植物自身生长状况以及外界环境的影响［16-17］。本研究通过OTU聚类和α多样性分析可知，病原菌的侵染明显改变了内生细菌群落结构，不同抗性品种发病块茎内生细菌OTU数量、菌群种类和丰富度指数均比健康块茎低；易感病品种闽薯2号发病块茎独有OTU比健康块茎明显提高，多样性指数降低，其变化规律与前人的研究结果［18-19］存在差异，可能是由于病原菌侵染诱导植株产生了大量次级代谢产物，造成马铃薯块茎内生细菌生存条件发生变化从而某一类型致病菌或者病原菌单一大量定殖，抑制其他种类微生物生长繁殖。而中抗病品种中薯566发病块茎独有OTU数量比健康块茎少，多样性指数变化幅度小。这与李佳等的研究结果相似，抗病品种中丰富的内生细菌以及病原菌侵染后仍可以维持较稳定的内生细菌多样性，从而加强了抗性品种对致病菌的抗性，并对植株起到一定的保护作用［20-21］。

不同抗性品種内生细菌优势菌门为变形菌门，变形菌门是在植物体内发现的最广泛的一个细菌菌门，其物种和遗传多样性极为丰富，广泛用于植物病虫害防治和生物固氮等方面［22］。病原菌侵染后，不同抗性品种发病块茎放线菌门相对丰度均比健康块茎呈现不同程度降低，这与王庆华等的研究结果相似，病原菌通过改变优势微生物的群落多样性，破坏了内生菌原有的生态平衡位点，为自身创造了更有利的生存环境［23］。中薯566发病块茎拟杆菌门相对丰度比健康块茎提高了200%，拟杆菌门细菌大多与致病菌相关［24］，中薯566拟杆菌门大量增加可能与致病菌侵染有关。

属水平上，不同处理的主要优势菌属为慢生根瘤菌属，次优势菌属因不同品种和有无感病情况表现出丰富的多样性，其中，中薯566病、健优势菌群种类和相对丰度均比闽薯2号多；闽薯2号发病块茎内生慢生根瘤菌属、假单胞菌属、黄杆菌属等有益菌群相对丰度不同程度降低，而中薯566相应有益微生物明显提高。这与前人的研究结果相似，一些促生菌和拮抗菌属在抗病品种病株中分布较多，可能与抗病品种内生菌受到外界病原菌侵染之后，会主动形成防御反应有关，通过增加自身群落数量和多样性以竞争和拮抗的方式抑制病原菌的生长繁殖［25-28］。闽薯2号发病块茎沙雷氏菌属相对丰度比健康块茎明显提高，沙雷氏菌是一类重要的生防菌，能分泌多种抗生性代谢产物，能有效抑制不同植物病原真菌的生长［29］，关于发病块茎沙雷氏菌属丰度提高的具体原因有待进一步研究。

放线菌是一类重要的生防微生物，由于其代谢类型和代谢产物十分丰富，从中分离获得的链霉素、阿维菌素、春雷霉素和井冈霉素等农用抗生素在病虫害防治中占具重要地位［30］。本研究发现，放线菌属是健康块茎的重要细菌类群，对马铃薯疮痂病拮抗内生菌的挖掘具有一定指导作用。隶属于伯克霍尔德氏菌目丛毛单胞菌科的Xenophilus细菌是健康和发病块茎间重要差异的微生物标识，Xenophilus可能是潜在的新物种，与块茎发病的关系有待进一步研究。

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