马铃薯DHN家族基因鉴定及干旱胁迫诱导表达分析

纪艺红　李越　白雪　温美沙　刘畅　许春江　李雅飞　王磊

摘要：马铃薯遭遇干旱胁迫时，会导致产量下降、品质降低。用生物信息学的方法，对马铃薯DHN（StDHN）基因家族进行全基因组鉴定，对其理化性质、染色体分布等进行分析，利用荧光定量的方法，对其在干旱胁迫下和不同组织中的表达模式进行分析。结果表明，StDHN基因家族共鉴定出5个家族成员，分布于1号、2号和4号染色体上，理化性质分析表明氨基酸长度为80～243个，分子量为8 544.27～25 121.94 ku，等电点（pI）的范围为5.24～7.38。StDHN蛋白的二级结构基本以无规卷曲为主，延伸链与β-转角的比例相当，仅有PG0009968以α-螺旋为主。对马铃薯DHN基因上游1 500 bp启动子区域顺式作用元件分析发现，DHN基因受到光的调控，平均每个基因中有10.4个光响应元件；还受到脱落酸（PG0015495、PG0003531、PG0009968）、赤霉素（PG0003531）等激素的调控；与逆境胁迫相关的包括低温响应元件（PG0030949、PG0003531、PG0009968）、干旱响应元件（PG0030949）等；生长发育调控元件包括胚乳表达（PG0015495）、种子特异性调控（PG0003531）、分生组织表达（PG0003531、PG0009968）。荧光定量结果发现，DHN基因參与干旱应答响应，也有可能参与马铃薯的生长调控。本研究为马铃薯中的耐旱候选基因研究提供参考。

关键词：全基因组；马铃薯；干旱胁迫；组织特异性；表达分析

中图分类号：S532.03 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）14-0058-07

植物遭受高盐、干旱或重金属等非生物胁迫逆境时，会导致生长发育缓慢、减产及品质降低［1-2］。植物会通过一系列防御机制，来应对各种伤害，从而增强对各种非生物胁迫的抵抗能力，帮助植物适应环境，例如积累可溶性渗透物（可溶性糖、甘氨酸甜菜碱等）及合成亲水性蛋白，如脱水素（dehydrins，简称DHNs）［3-5］，一种高亲水性蛋白质，在细胞核、液泡、细胞质、线粒体和叶绿体等植物细胞结构中广泛存在［6］，由Dure 最早发现于 20 世纪 80 年代［7］。研究表明，在非生物胁迫的抗逆过程中，脱水素基因扮演着重要的作用［8］，目前研究较多的是广泛参与渗透调节相关功能的一类 LEA 蛋白［9］，该类蛋白可与分子伴侣、渗调蛋白和解毒酶协同作用，在逆境下调控植物细胞的正常代谢活动［10-11］。

据报道，DHN 基因与生物的抗逆性密切相关，当植物遭受如干旱、高盐和温度胁迫等与细胞脱水相关的非生物胁迫时，DHNs在营养组织中大量积累，从而保护蛋白质、核酸和细胞膜等［12-13］。很多研究表明，脱水素与干旱及盐胁迫的调控相关［14］。过量表达 DHN类基因可以提高拟南芥、水稻、烟草、草莓、 酵母和大肠杆菌等应对抗寒、抗旱或耐盐能力的非生物胁迫能力［15-18］。水稻植株过表达 OsDHN1，抗旱和耐盐性与野生型相比显著增强［19］。在番茄中，过量表达雪莲 SiDHN基因，可以提高植株的抗旱能力［20］。在小立碗藓中，PpDHNA 和 PpDHNB 在盐和甘露醇胁迫下被强烈的诱导上调表达［21］。与野生型烟草相比，过表达枇杷脱水素基因 EjDHN1能够显著提高转基因烟草植株的抗寒能力［22］。CaDHN5在辣椒中对盐胁迫起正调控作用，此外，也有研究发现 DHNs与重金属的应答和解毒相关［23］。SiDHN2受低温胁迫上调表达［24］。在芥菜中，烟草中过表达的2个脱水素基因 BjDHN2 和 BjDHN3受重金属诱导，提高了过表达烟草植株对重金属 Cd 和 Zn的抵抗能力［25］。在烟草中，过量表达玉米脱水素基因 ZmDHN13，有利于提高转基因植株对 Cu 胁迫的抗性［26］。大麦脱水素基因 DHN3被干旱、ABA 和盐胁迫诱导［27］。

本研究主要对马铃薯中的DHN基因进行鉴定，分析了它们在染色体上的分布，对马铃薯中DHN基因启动子区的顺式元件、组织器官表达模式以及非生物胁迫下的表达模式进行研究，有助于了解DHN基因在马铃薯抗逆分子机制中的作用，为进一步对马铃薯的遗传改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间及地点

本试验于2022年8月在河北北方学院旱作农业研究中心实验室完成。

1.2 马铃薯基因组中StDHN成员的鉴定及染色体定位

马铃薯基因组信息、蛋白质和CDS序列及染色体位置等信息均下载自在线数据资源（PGSC，https：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download. shtml）。以含有DHN保守结构域degydrin的HMM模型（PF00257）作为模板在Pfam（http：//pfam. xfam. org/）中搜索，利用HMM 3.0比对（http：//hmmer. org/download. Html），使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）网站进行验证，最终得到5个含有degydrin保守结构域的StDHN成员。

根据基因组的注释信息和StDHN家族基因成员在染色体上所对应的位置，使用MapChart软件绘制StDHN基因的染色体位置图，用Adobe Illustrator 2020软件进行美化处理。

1.3 马铃薯StDHN家族成员的序列和结构特征分析

使用Expasy网站（http s：//www. exp asy. org/vg/index/Protein）计算StDHN成员的氨基酸数量、蛋白质分子量（molecular weight，简称MW）以及理论等电点（isoelectric point，简称pI）；将StDHN家族成员序列上传至CELLO（http：//cello.life. nctu. edu. tw/），进行亚细胞定位分析；使用SOPMA（http：pbil.ibcp.fr/）在线预测5个StDHN蛋白质二级结构。

使用MEME（http：//meme-suite. org/tools/meme），搜索识别所有StDHN家族基因的蛋白保守基序（motif）。使用Gene Structure Display Server 2.0（GSDS 2.0 http：//gsds.gao-lab.org/index.php）确定基因内含子和外显子结构，用Adobe Illustrator 2020软件进行美化处理。

1.4 马铃薯StDHN家族成员顺式作用元件预测

通过perl脚本检索，将马铃薯基因数据库中每个StDHN基因的启动子序列（5′非翻译区上游 1.5 kb）上传于Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），进行搜索检测，将顺式作用元件按功能归类后，使用Gene Structure Display Server 2. 0（GSDS 2.0 http：//gsds.gao-lab.org/index.php）将结果进行可视化。

1.5 马铃薯StDHN家族的表达模式分析

使用马铃薯品种冀张薯8号组培苗，采用浓度15 % 的PEG处理0、6、12、24 h后，5株混合取样，试验重复3次，在液氮中速冻，存放于-80 ℃，提取植株RNA，反转录为cDNA，用于分析干旱胁迫下的表达模式。在开花期取不同组织（花、根、茎、叶、块茎、葡匐茎）分析各基因在不同组织中的表达模式。使用Premier 6.0对马铃薯DHN家族进行查找设计引物（表1），以elongation factor 1-α为内参基因，qPCR反应体系（20 μL）：cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL、上下游引物各 1 μL、SYBR Premix MIX 10 μL。 反应条件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共计40个循环。

组织中将茎中表达量设为1，干旱胁迫以未处理的材料（0 h）作为对照，表达量设为 1。使用2-ΔΔCT方法计算和分析，使用GraphPad Prism 9软件绘图。

2 结果与分析

2.1 StDHN的鉴定及染色体分布

通过生物信息学方法，利用HMMER进行搜索，结果共鉴定出9个候选StDHN基因，利用Smart检测，去除冗余后，在马铃薯中共鉴定出了5个DHN基因家族成员。

通过染色体定位分析（图1）发现，StDHN基因在4号染色体上分布最多，为3个（PG0003530、PG0003531、PG0015495），1号染色体上为1个（PG0030949），7号染色体上分布1个（PG0009968）。其中，PG0030949和PG0009968分别位于染色体的下端，PG0003530、PG0003531、PG0015495基因位于染色体中间位置，其余染色体上没有发现StDHN基因的分布。

2.2 StDHN蛋白的理化性质和亚细胞定位

由表2可知， StDHN家族成员的氨基酸长度和理化性质存在较大的差异，包括基因名称、转录本登录号、染色体位置、氨基酸数量（AA）、分子量（MW）、等电点（pI）和亚细胞定位。氨基酸长度为80（PG0015495）～243个氨基酸（PG0030949）。分子量为8 544.27 ku （PG0015495）至25 121.94 ku （PG0005573），等电点（pI）的范围为5.24（PG0009968）～7.38（PG0030949）。3个StDHN氨基酸序列（PG0003530、PG0003531、PG0030949）理论等电点在酸性范围（pI>7）内，2个PG0009968、PG0015495）理论等电点在碱性范围（pI<7）内。亚细胞定位预测结果表明，各成员均定位于细胞核中。

2.3 StDHN基因结构和motif分析

构建基因结构图谱，结果（图2）显示，该家族成员结构基本相似，内含子数目相同，均只含有1个内含子。为了更全面了解DHN蛋白的保守基序组成元件，利用在线MEME程序，预测了DHN蛋白的10个保守基序。分析发现，StDHN结构域存在多种组成形式，如motif1和motif 5、motif 8和motif 10，含有3～9个数目不等的motif。每个成员的motif组成相对保守，每个基因中均有motif1和motif4，基因结构则较为相似（图3）。

2.4 StDHN蛋白二级结构

StDHN蛋白的二级结构基本以无规卷曲为主，延伸链与β-转角的比例相当，仅有PG0009968以α-螺旋为主（图4、表2）。

2.5 马铃薯StDHN家族基因的顺式作用元件

选取马铃薯基因组StDHN家族基因起始密码子上游1 500 bp进行分析，结果（图5）表明，在马铃薯StDHN家族基因中除启动子区域的核心元件外，共鉴定出97种不同的顺式作用元件，主要由光响應元件、逆境胁迫响应元件、生长发育响应元件等组成。在马铃薯DHN基因家族含有的启动子元件中光响应元件数量最多，光响应元件分布在所有家族成员中，平均每个基因中有10.4个。植物激素调控相关元件包括茉莉酸响应元件为14个，分布于3个基因（PG0015495、PG0030949、PG0009968）中；脱落酸响应元件10个，分布于3个基因（PG0015495、PG0003531、PG0009968）中；赤霉素诱导元件1个（PG0003531）。逆境胁迫相关元件包括低温响应元件（PG0030949、PG0003531、PG0009968）、 干旱响应元件（PG0030949）等。生长发育调控元件包括胚乳表达（PG0015495）、种子特异性调控（PG0003531）、分生组织表达（PG0003531、PG0009968）等元件。

2.6 StDHN基因组织特异性分析

组织表达结果（图6）显示，StDHN各个基因在马铃薯不同部位的表达量存在差异，而且基因间也存在差异。将茎部表达量设为1，PG0003531在花中相对表达量最高，与茎相比具有极显著差异，在块茎中几乎不表达；PG0003530在花、块茎和葡匐茎中的表达量低于茎中的表达量，具有极显著差异；PG0009968在根中的表达量高于茎，具有极显著差异，葡匐茎中的表达量也较高，具有显著差异；PG0030949在葡匐茎和叶片中表达量较高，具有极显著差异；PG0015495基因在各组织中表达量无差异。因此，推测StDHN基因可能会参与调控马铃薯的生长发育，在不同部位中发挥了作用。

2.7 StDHN基因在干旱胁迫下的表达分析

为了研究DHN家族基因在干旱处理下的表达模式，在马铃薯中进行荧光定量分析。结果（图7）发现，PG0015495基因积极响应干旱胁迫，受到干旱胁迫时表达量均高于0 h，在24 h时达到最高，与 0 h 相比具有极显著差异；PG0003530基因受到干旱胁迫时，表达受到抑制，与0 h相比，均低于0 h的表达量，其中6 h和12 h时与0 h相比具有极显著差异；在干旱胁迫时，PG0030949表达趋势先升高后降低，在6 h时显著高于0 h，在12 h和24 h时基因表达量降低，低于0 h；PG0003531和PG0009968基因表达趋势一致，与0 h相比没有显著差异。

3 讨论与结论

本研究表明，DHN基因参与了非生物胁迫的响应对植物的抗逆、生长发育等起着重要的作用。根据报道，其中苹果中的DHN家族成员数量最多，共有12个成员［28］；最少的为葡萄［29］和黄瓜［30］，仅有 4 个成员；梨［31］和猕猴桃［32］中均鉴定到 7个成员；萝卜［33］中鉴定到 11 个成员，目前，马铃薯DHN家族基因还未被研究。本研究在马铃薯中共鉴定出5个StDHN基因，与前人在苹果、葡萄、黄瓜、梨、猕猴桃、萝卜等物种中鉴定出的个数有所不同，数目较少，通过对该家族成员的基因复制事件分析，发现该基因家族不存在片段重复和串联重复，推测这可能是该基因家族较少的原因之一。

在本研究中，马铃薯DHN家族基因的等电点为5.24～7.38，与已经报道的拟南芥、番茄、烟草、白菜的结果一致，说明其编码的蛋白具有相似的功能。马铃薯5个StDHN基因家族均含有1个内含子，基因结构高度一致，说明DHN可能存在相似的生物学功能。本研究利用SMART网址分析马铃薯DHN的保守结构域，结果显示，所有的DHN蛋白均包含Dehydrin结构域。通过分析motif发现，马铃薯DHN家族基因含有3～9个数目不等的motif，每个基因中均有motif1和motif 4，组成相对保守，推测该基因家族在功能保守的同时，不同的基因的功能发生分化。通过启动子顺式作用元件发现，马鈴薯DHN家族基因在激素响应、逆境胁迫、光调控及生长发育等方面可能发挥着一定的作用。

本研究发现，StDHN家族成员PG0003531、PG0003530、PG0009968在不同的器官中表达具有显著差异，因此，推测在生长发育过程中该基因可能参与马铃薯的生长调控，在不同部位的生长发育中发挥了作用。分析马铃薯DHN家族基因在干旱胁迫下的表达模式，发现干旱胁迫处理时，PG0015495、PG0003530、PG0030949基因与对照相比具有不同的响应模式，说明马铃薯DHN基因广泛响应干旱胁迫。

分子抗性育种是马铃薯育种中的重要课题之一，马铃薯基因组测序的完成和不断完善，为深入研究这些基因的功能以及上游和下游的调控蛋白提供了基础，本研究通过对StDHN家族基因的分析，为今后提高马铃薯的耐旱性和改良马铃薯耐旱新品种提供理论依据，StDHN家族的功能及通过何种途径提高马铃薯的抗性仍需进一步研究阐明。

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收稿日期：2022-10-12

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-09-P05）；河北省张家口市基础研究和人才培养计划项目（编号：2221015A）；

河北省教育厅自然科学类青年项目（编号：QN2021011）；

河北省马铃薯产业协同创新中心项目（编号：［2016］5号）。

作者简介：纪艺红（1990—），女，河北张家口人，硕士，助理研究员，研究方向为分子抗逆育种。E-mail：281030822@qq.com。

通信作者：王 磊，博士，讲师，研究方向为马铃薯种质资源创新。E-mail：wanglei@hebeinu.edu.cn。