肺癌颅脑转移动物模型建立的比较

涂洵崴 李鸿茹 陈正伟 王大璇

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其主要死亡原因是发生脑转移。近年来，肺癌的发病率逐年升高，肺癌颅脑转移的发病率也随之升高。在临床上有20%～30%的肺癌患者在确诊时已经发生了颅脑转移，40%～50%的肺癌患者在整个病程中会出现颅脑转移。肺癌颅脑转移导致患者预后不良、神经损害症状、生存质量下降、生存期减短，未经治疗的中位生存期为1～3个月[1-3]。然而，目前对肺癌颅脑转移发生的具体机制还不清楚，需要临床相关的实验动物模型来具体研究。本实验通过比较不同注射途径的方法建立肺癌颅脑转移的实验动物模型，即通过左心室注射、尾静脉注射和胸腔注射具有颅脑转移潜力的PC-9人肺腺癌细胞，以探究颅脑转移动物模型建立的最佳注射途径，为研究颅脑转移的具体机制提供可靠的造模方法。

1 材料与方法

1.1 一般材料

BALB/c NUDE裸小鼠，雌性，体质量16～18 g/只，4～6周龄，健康，购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK（沪）2021-005]，随机分配至左心室注射组、尾静脉注射组、胸腔注射组，每组6只。通过剪裸鼠耳朵标记裸鼠的左耳上下、右耳上部位，为裸鼠编号。所用的饲料、水、垫料都经过严格灭菌处理，并按动物实验的3R原则给予人道的关怀。RPMI 1640 培养基（HyClone公司，美国）、新生胎牛血清（杭州四季青生物技术公司，中国）、1%Pen-Strep双抗（HyClone公司，美国）、0.25%胰酶-EDTA（Gibco公司，美国）、1 mL胰岛素注射器（舒锐公司，美国）、生物安全柜（北京东联哈尔、中国），CO2培养箱（上海力申科仪、中国）、倒置显微镜（奥林巴斯公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

PC-9细胞株，具有颅脑转移潜能的人肺腺癌细胞系购买自中南大学湘雅医学院实验中心，以含体积分数为10%灭活新生胎牛血清、1% Pen-Strep双抗、1%谷氨酰胺的RPMI 1640培养液培养，培养条件为37℃、5% CO2，并以0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 细胞悬液置备

当镜下观察细胞生长状况良好时，取对数生长期的细胞，经胰酶消化制备细胞悬液，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清液。加入无血清的1640培养基，再经吹打、离心，以无血清培养基重悬制备单细胞悬液。

1.2.3 细胞计数

吹打混匀细胞，取4滴细胞悬液、4滴台盼蓝染液混于离心管中，活细胞不被染。将混匀的细胞悬液滴入细胞计数板中，统计四大格的活细胞及死细胞数，细胞量/mL＝（四大方格细胞总数/4）×104×2/mL。台盼蓝染色示细胞存活率＞90%（细胞存活率＝活细胞数/细胞总数×100%）。离心并重悬细胞至密度分别为1×107个/mL。

1.2.4 接种动物

左心室注射组：裸鼠麻醉、固定、消毒后，在胸骨左缘第二肋间旁开2 mm处进针。

尾静脉注射组：裸鼠固定后，用酒精擦拭尾巴消毒并扩张血管，于尾部中外1/3处进针。

胸腔注射组：裸鼠右侧卧位固定、消毒后，在腋后线第6肋间进针，以进针突破感后再进针3～4 mm为准。三组均注入0.1 mL（即1×106个肿瘤细胞）的PC-9细胞悬液。在无特定病原体（specific pathogen free，SPF）环境内饲养接种后的裸鼠。

1.2.5 标本留取

定期称重，观察裸鼠情况，注意裸鼠有无出现共济失调、偏瘫、跛行，当裸鼠出现恶病质，表现为弓背、消瘦、食欲减退时，处死裸鼠，解剖及HE染色观察肺脏、颅脑。

1.3 观察指标

1.3.1 裸鼠情况

记录裸鼠体质量、观察裸鼠一般情况以及注意有无共济失调、偏瘫、跛行。

1.3.2 形成肺部肿瘤及颅脑转移情况

在无菌条件下解剖小鼠，观察肺、脑脏器有无转移灶，肉眼见病灶给予拍照记录，取出肺组织、脑组织，以10%甲醛溶液固定，行常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察转移情况。

2 结果

2.1 裸鼠情况

（1）左心室注射组：注射后18 d裸鼠开始出现体质量下降，恶病质逐渐出现，期间表现为共济失调、偏瘫、跛行的裸鼠有5只（图1-A）。（2）尾静脉注射组：注射后55 d裸鼠体质量开始减轻，92 d开始出现恶病质，期间均未出现共济失调、偏瘫、跛行。（3）胸腔注射组：注射后22 d，裸鼠出现胸壁瘤结；体质量在35 d开始下降，恶病质逐渐出现，期间均未出现共济失调、偏瘫、跛行。

图1 裸鼠情况

2.2 形成肺部肿瘤及颅脑转移

（1）左心室注射组：裸鼠27 d处死，肺（图1-B）解剖观察无异常，颅脑无异常；HE染色证实，6只裸鼠肺内肿瘤病灶均未检出；转移灶见所有裸鼠颅脑（图1-C）。（2）尾静脉注射组：裸鼠于112 d处死，解剖观察肺（图1-B）及颅脑无异常；HE染色证实4只裸鼠身上出现了肺部肿瘤灶；6只裸鼠均未发现颅脑转移。（3）胸腔注射组：裸鼠于42 d处死，观察肺及胸腔见多发肿瘤结节、团块，并胸膜、肋骨、脊柱浸润（图1-D）；HE染色证实6只裸鼠均出现肺转移灶；均未发现颅脑转移。

3 讨论

肺癌是常见的高发病率、高死亡率的恶性肿瘤[4]。大量患者死于晚期远处转移，尤其是脑部转移[5]。颅脑转移严重影响患者预后，故高效的颅脑转移实验动物模型对于肺癌颅脑转移机制研究有重大意义。其他颅内转移瘤主要来自乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤以及未知组织来源的肿瘤[6-8]。目前，国际上对颅脑转移实验动物模型的研究比较关注，国内外学者尝试用各种不同的方法，包括尾静脉注射、左心室或颈内动脉注射及脑立体定位原位种植途径，相关的动物模型也已陆续被建立，然而均存在成功率不高或操作复杂的局限性[9-16]。因此，建立合适的实验性动物模型，用于肺癌的颅脑转移研究就成了重中之重。

课题组通过对比肺癌颅脑转移的实验动物模型，采用左心室注射、尾静脉注射、胸腔注射的方法，发现左心室注射方法颅脑转移形成率达到100%，而尾静脉注射、胸腔注射的方法未发现脑转移灶。查阅相关文献，分析如下：左心室注射方法，心室解剖位置较易定位，技术难度较颈内动脉注射法降低，心室内血液容积大及被迅速泵入动脉，注射入的肿瘤细胞不易形成细胞团簇，有利于肿瘤细胞随血液扩散；经左心室注射的肿瘤细胞，直接入动脉，能够很快到达脑部毛细血管床，减少过程中被消灭的可利用的肿瘤细胞数，有助于颅脑转移形成[17-21]。左心室注射的方法很好地模拟了肺癌的血行转移，即通过肺微血管床的肿瘤细胞进入左心室，经血流流向脑部，产生脑转移[22]。再则，左心室注射使肿瘤细胞滞留在肺微血管床的时间减少，肿瘤细胞经脑实质的数量增加，肿瘤细胞因肺癌而死亡的时间推迟，进而使肿瘤细胞在脑内生长和增殖的时间延长，从而获得较高的脑转移率；而尾静脉注射、胸腔注射的方法，肿瘤细胞首先经静脉滞留肺部，只有通过肺微血管床以及从肺转移灶脱离的肿瘤细胞进入体循环，才能形成脑转移可能。本实验发现，尾静脉注射组、胸腔注射组，裸鼠在颅脑转移灶形成前，就因不堪肺脏及胸腔负瘤情况而出现恶病质死亡，且两组中裸鼠生存周期相比较长，导致实验周期延长。然而，左心室注射组裸鼠出现恶病质的时间明显缩短，与临床经验相符，证明肺癌颅脑转移严重缩短患者的生存周期。

此外，本实验选择的是具有肺癌颅脑转移潜能的PC-9细胞株，肿瘤转移模型的建立有赖于高致瘤能力的肿瘤细胞，研究结果表明只有少数肿瘤细胞能够引起肿瘤发生、转移，而大部分并不具备转移、侵袭能力，且对于同一恶性肿瘤而言，其细胞的增殖、侵袭和转移特性并不完全相同[23]。按照“种子与土壤”转移学说的观点，是肿瘤细胞异质性与靶器官微环境相互作用的结果，也就是说，肿瘤转移具有器官特异性，不同的肿瘤具有对不同靶器官不同的亲和性，从而形成进入动脉系统形成特定器官的肿瘤细胞转移[24-25]。

关于左心室注射的方法：前期课题组先在小白鼠上实践，考虑到与注射时间、接种细胞浓度（单细胞悬液1×108/mL）易栓塞有关，发现小白鼠有即时死亡或数小时或隔天死亡的现象；还有一些小白鼠在开胸后，考虑到注射时肿瘤细胞向胸腔或针管外漏可能，因此在胸腔内出现了微小种植灶的现象。所以总结左心室注射心得如下：（1）注射器：选择BD牌1 mL胰岛素注射器。（2）体位摆放：仰卧位固定，保证心脏体表位置处皮肤充分舒展；最好保证每只裸鼠仰卧位舒展的体外相对一致，以保证进针点的一致性。（3）进针前准备：进针前调节好BD针头至滞留空气0.05 mL后，再吸取细胞悬液0.1 mL。（4）进针点：仰卧位裸鼠胸前皮肤经酒精消毒后，可以清晰暴露裸鼠肋骨各位置；于胸骨左缘第二肋间旁开2 mm处进。（5）进针角度：针尖斜面朝向脚端，与地面成30°～45°角，注意缓慢进针。（6）进针：以突然见到血液喷射为标志，并在此时停止进针；并尽可能快速地推动注射器（10 s内），细胞悬液快推完时，及时拔出，以免注入空气；如果一次尝试未见血液喷射，重新改变进针点。目前，关于肺癌颅脑转移的动物模型相对较少，大家都在探索阶段，对细胞株和注射途径的选择未形成共识。本实验选择具有颅脑转移潜能的人肺腺癌细胞株PC-9，采用左心室注射途径，建立肺癌颅脑转移模型具有明显的高转移率。

综上所述，对于肺癌颅脑转移实验动物模型的建立，经左心室注射途径，提供了一种可行的建模方法。