LB对IL-17A诱导HaCaT细胞增殖和细胞因子影响

冯世军　马敬　李华蕊　刘远　艾东方　楚瑞琦

［摘要］目的探討龙血素B（LB）对白细胞介素-17（IL-17A）诱导的HaCaT细胞增殖和细胞因子分泌的影响及其机制。方法采用噻唑蓝检测细胞增殖；酶联免疫吸附检测IL-6和IL-23表达，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测趋化因子（CXCL1、CXCL12、CXCL20）mRNA表达量，蛋白免疫印迹方法检测Janus激酶-信号转导子及转录激活子（JAK-STAT）通路相关蛋白Janus激酶1（JAK1）、磷酸化信号转导子和转录激活子3（p-STAT3）、信号转导子和转录激活子3（STAT3）的表达。结果与对照组相比，IL-17A组的吸光度值（A值）及IL-6、IL-23和CXCL1、CXCL12和CXCL20 mRNA表达明显增加（F=34.76～135.70，P<0.001），JAK1、p-STAT3和STAT3蛋白表达上调（F=53.91～105.70，P<0.001）。IL-17A可以剂量依赖性地降低HaCaT细胞的A值，IL-6、IL-23，CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA含量及JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白量（F=22.55～88.41，P<0.001）。与IL-17A+LB-H组相比，IL-17A+LB-H+AG490组的A值、IL-6、IL-23和CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA明显降低（t=4.73～8.40，P<0.001）。结论LB能抑制IL-17A诱导的HaCaT细胞增殖及相关细胞因子分泌，其作用机制可能与抑制JAK-STAT通路有关。

［关键词］龙血素B；HaCaT细胞；白细胞介素17；细胞增殖；细胞因子类；JAK-STAT通路；银屑病

［中图分类号］R284;R73-3［文献标志码］A［文章编号］2096-5532（2023）03-0416-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.077［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1517.r.20230725.0937.004.html;2023-07-2710：58：27

EFFECT OF LOUREIRIN B ON THE PROLIFERATION AND CYTOKINE SECRETION OF HACAT CELLS INDUCED BY IL-17A  FENG Shijun， MA Jing， LI Huarui， LIU Yuan， AI Dongfang， CHU Ruiqi （Department of Dermatology， The Central Hospital of Cangzhou， Cangzhou 061001， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of loureirin B （LB） on the proliferation and cytokine secretion of HaCaT cells induced by interleukin-17A （IL-17A）. MethodsMTT assay was used to determine cell proliferation; enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the expression of interleukin-6 （IL-6） and interleukin-23 （IL-23）; quantitative real-time polymerase chain reaction was used to measure the mRNA expression of chemokines （CXCL1， CXCL12， CXCL20）; Western blotting was used to measure the protein expression of Janus kinase 1 （JAK1）， phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3 （p-STAT3）， and signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3）. ResultsCompared with the control group， the IL-17A group showed significant increases in absorbance， the levels of IL-6 and IL-23， and the mRNA expression of CXCL1， CXCL12， and CXCL20 （F=34.76-135.70，P<0.001）， as well as significant upregulation of the protein expression of JAK1， p-STAT3， and STAT3 （F=53.91-105.70，P<0.001）. LB reduced the absorbance， IL-6 and IL-23 levels， CXCL1， CXCL12， and CXCL20 mRNAs， and JAK1， p-STAT3， and STAT3 proteins of HaCaT cells in a dose-dependent manner （F=22.55-88.41，P<0.001）. Compared with the IL-17A+LB-H group， the IL-17A+LB-H+AG490 group showed significant reductions in absorbance， IL-6 and IL-23 levels， and CXCL1， CXCL12， and CXCL20 mRNAs （t=4.73-8.40，P<0.001）. ConclusionLB can inhibit the proliferation and cytokine secretion of HaCaT cells induced by IL-17A， possibly by suppressing the JAK-STAT pathway.

［KEY WORDS］loureirin B; HaCaT cel; interleukin-17; cell proliferation; cytokines; JAK-STAT pathway; psoriasis

银屑病是临床常见的一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，全球发病率为0.09%～5.10%[1]。银屑病组织病理学主要表现为角质层细胞增殖、炎性细胞浸润等[2]。白细胞介素-17（IL-17A）是辅助性T-17细胞分泌的因子之一，已被证实参与银屑病等多种皮肤病的免疫发病机制[3]。HaCaT细胞具有与正常角质形成细胞相似的生物学特性，常被用作体外研究皮肤病的细胞模型[4]。龙血竭是中国传统的名贵中药，是百合科龙血树属植物剑叶龙血树的含脂木材经过乙醇提取分离制得的树脂，具有活血化瘀、止血、定痛、敛疮生肌等功效。现代药理学研究发现，龙血竭具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理活性[5]。龙血素B（LB）是龙血竭二氢查耳酮类化合物，能够抑制HaCaT细胞的增殖、迁移和侵袭[6]，但是其对IL-17A诱导的HaCaT细胞增殖的影响未见相关研究。近年的研究结果显示，JAK-STAT3通路可以作为治疗银屑病的重要靶点之一[7]，清热利湿饮通过抑制JAK-STAT3通路的表达降低HaCaT细胞炎性因子的分泌[8]。因此，本研究首次采用IL-17A刺激HaCaT细胞，探讨LB是否可通过调控JAK-STAT通路影响IL-17A诱导的HaCaT细胞增殖和细胞因子分泌。

1材料与方法

1.1实验材料

HaCaT细胞购于中国科学院上海细胞库；胎牛血清、DMEM培养基购于美国Gibco公司；IL-17A购于Peprotech公司；LB购于中国食品药品检定研究院（批号：201909）；JAK/STAT信号通路抑制剂AG490购于Sigma公司；MTT试剂盒购于上海东仁化学科技公司；ELISA试剂盒购于赛默飞世尔公司；引物购于上海吉玛公司；Trizol试剂盒、反转录试剂盒、Ultra SYBR Mixture试剂盒购于北京康为世纪生物；JAK1抗体、p-STAT3抗体、STAT3抗体和GAPDH抗体购于美国CST公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养将HaCaT细胞常规复苏后在含有体积分数0.10胎牛血清以及10 g/L青链霉素的DMEM培养液内进行培养，并放置在37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱内，2～3 d内换1次培养液，细胞融合至85%进行传代培养。

1.2.2实验分组及处理选择处于对数生长期的HaCaT细胞接种至96孔细胞板内，常规条件下未进行处理的HaCaT细胞，记为对照组（Con组，A组）；采用浓度为200 μg/L IL-17A诱导HaCaT细胞，记为IL-17A组（B组）；采用LB浓度为5、25、50 mg/L和IL-17A浓度为200 μg/L进行处理的HaCaT细胞，分别记为IL-17A+LB-L组（C组）、IL-17A+LB-M组（D组）和IL-17A+LB-H组（E组）；选择LB（浓度50 mg/L）、IL-17A（200 μg/L）和JAK/STAT信号通路抑制剂AG490（20 mol/L）处理的HaCaT细胞，记为IL-17A+LB-H+AG490组（F组）。细胞培养48 h后进行后续实验。

1.2.3MTT检测细胞增殖对1.2.2各组HaCaT细胞调整细胞密度并接种在96孔板内，在培养箱内培养48 h，按照MTT试剂盒说明书检测细胞增殖活性，然后在酶标仪490 nm处检测细胞的吸光度值（A值）。

1.2.4ELISA检测IL-6、IL-23的表达取1.2.2各组HaCaT细胞，3 000 r/min离心10 min后分别收集细胞上清液，按照ELISA法检测IL-6、IL-23的表达。

1.2.5qRT-PCR检测CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA表达量取1.2.2各组HaCaT细胞按照Trizol法提取各组细胞的总RNA，根据反转录试剂盒说明书合成cDNA，以β-actin作为内参照。按照Ultra SYBR Mixture试剂盒进行PCR扩增，反应条件为：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共45个循环。采用2-ΔΔCt公式计算CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA表达量。PCR所用引物及其序列见表1。

1.2.6Western blot检测JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表达取1.2.2各组的HaCaT细胞，加入蛋白裂解液后提取细胞的总蛋白。煮沸变性取30 μg蛋白样品，经过SDS-PAGE凝胶电泳处理，转膜，封闭培养，分别加入JAK1（1∶1 000）、p-STAT3（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）抗体，4 ℃过夜培养。加入带有标记的二抗，37 ℃培养2 h。在膜上滴加ECL，顯色曝光，定影。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH作为内参。

1.3统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件分析处理实验数据。计量资料采用±s形式表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。

2结果

2.1LB对HaCaT细胞增殖、细胞因子分泌和趋化因子的影响

与A组相比，B组48、72 h细胞增殖的A值显著增加（F=34.76～33.09，P<0.01），IL-6、IL-23显著增加（F=135.70、105.10，P<0.001），CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA表达量显著增加（F=68.60～82.39，P<0.001）。与B组相比，C组、D组、E组的48、72 h细胞增殖的A值显著降低（F=22.55～27.03，P<0.001），IL-6、IL-23显著降低（F= 88.41、51.55，P<0.001），CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA的表达量显著降低（F=34.00～45.53，P<0.001）。见表2。

2.2LB对细胞中JAK-STAT通路蛋白表达影响

与A组相比，B组的JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表达显著增加（F=53.91～105.70，P<0.001）；与B组相比，C组、D组、E组的JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表达显著降低（F=26.42～47.36，P<0.001）。见图1和表3。

2.3阻断JAK-STAT通路后LB对HaCaT细胞增殖、细胞因子分泌和趋化因子表达的影响

与IL-17A+LB-H组相比，IL-17A+LB-H+AG490组的48 h及72 h细胞增殖的A值、IL-6、IL-23和CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA表达量显著降低，差异具有统计学意义（t=5.40～8.40，P<0.001）。见表4。

3讨论

银屑病是基于遗传背景下的与免疫相关的慢性炎症性疾病，与细胞免疫有关[9]。现已经证实，IL-17A在银屑病中表达异常升高，参与HaCaT细胞的增殖和炎症因子的分泌，在银屑病的发生发展中起重要作用[10]。IL-6和IL-23是多种免疫细胞的致炎因子，可参与细胞的免疫和炎症反应等多种病理生理过程[11]。趋化因子是一类由组织细胞和炎性细胞产生的小分子分泌蛋白，主要有4种亚型，其中CXCL1、CXCL12和CXCL20在巨噬细胞、中性粒细胞和角质形成细胞等多种细胞中表达，并参与细胞的炎症反应和血管生成等过程[12]。有研究报道，趋化因子参与银屑病的发生和发展，通过药物干预细胞的炎症反应，对银屑病的治疗具有重要意义[13]。本研究采用IL-17A处理HaCaT细胞后的结果显示，细胞增殖明显升高，IL-6和IL-23因子分泌增多，CXCL1、CXCL12和CXCL20 mRNA表达上调，提示IL-17A促进了HaCaT细胞的增殖和细胞因子的分泌。龙血竭的化学成分较为复杂，有萜类、甾体和酮类等，其中LB是酮类的主要活性成分，具有抗炎、抗菌和降低血糖等药理作用[14]。本研究采用不同浓度LB处理HaCaT细胞的体外实验表明，细胞增殖明显降低，IL-6、IL-23因子分泌减少，CXCL1、CXCL12和CXCL20 mRNA表达下调，表明LB能够抑制IL-17A诱导的HaCaT细胞增殖和细胞因子的分泌。

有研究显示，IL-6、IL-12和IL-17A等因子可启动JAK-STAT通路中的信号转导通路，活化下游JAK1、STAT3等，进而影响STAT3的磷酸化[15]。陈飚等[16]的研究结果则显示，STAT1、STAT3等mRNA和蛋白表达在银屑病病人皮损区角质形成细胞中上调，提示其与银屑病的发病机制有关。解欣然等[17]研究结果显示，丹皮酚通过调控STAT3通路减缓IL-17A诱导的HaCaT细胞增殖和细胞因子的分泌。本文研究结果表明，IL-17A能诱导HaCaT细胞JAK1、p-STAT3和STAT3蛋白表达上调，经过不同浓度LB处理后，JAK1、p-STAT3和STAT3蛋白表达下调，说明LB可抑制IL-17A对JAK-STAT通路的激活作用。JAK-STAT信号通路抑制剂AG490可以选择性地降低STAT3的磷酸化[18]，也可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的异常行为[19]。进一步实验研究显示，AG490能够降低细胞增殖，抑制IL-6、IL-23因子分泌，下调CXCL1、CXCL12和CXCL20 mRNA表达，表明LB可通过抑制JAK-STAT通路减缓银屑病的发展。

综上所述，LB可通过抑制JAK-STAT通路减缓IL-17A诱导HaCaT细胞增殖和细胞因子的分泌，这为LB治疗银屑病的可能作用机制提供了理论基础。然而，LB是否可通过其他通路调节JAK-STAT通路进而参与HaCaT细胞表型的调控，仍有待进一步探讨。

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（本文编辑牛兆山）