2019—2021年四川成都某医院淋病奈瑟菌对大观霉素、阿奇霉素及头孢菌素类药物敏感性检测及结果分析

王有为?杨阳?赵薇?陈媛玮?李红霞?张欣?雍刚

摘要：目的 檢测我院2019—2021年淋病奈瑟菌临床分离菌株对大观霉素、阿奇霉素及头孢菌素类药物的敏感性，为淋病的治疗和防控提供参考。方法 收集并保存淋病奈瑟菌临床分离株，琼脂稀释法和微量肉汤稀释法测定大观霉素、阿奇霉素、头孢曲松和头孢克肟的最小抑菌浓度（ MIC） ，分析比较菌株对各药物的耐药率或低敏率。结果 2019—2021年共分离收集淋病奈瑟菌菌株279株。其中未发现对大观霉素的耐药菌株；发现对阿奇霉素耐药菌株31株，耐药率分别为16.00%、8.82%和8.11%，平均耐药率为11.11%；发现对头孢曲松低敏菌株43株，低敏率分别为12.00%、14.71%和18.92%，平均低敏率为15.41%；发现对头孢克肟低敏菌株27株，低敏率分别为4.00%、2.94%和18.92%，平均低敏率为9.68%。每年发现同时对头孢曲松低敏和阿奇霉素耐药的菌株数量均为2株，占比分别为2.00%、2.94%和1.80%，总体占比2.15%。结论 大观霉素和头孢曲松仍适合本地区作为治疗淋病的一线药物，需关注本地区淋病奈瑟菌对头孢曲松低敏率的逐年增长趋势。

关键词：淋病；淋病奈瑟菌；药物敏感性检测；微量稀释法、最小抑菌浓度

中图分类号：R978.1文献标志码：A

The analysis of antimicrobial susceptibility test of Neisseria gonorrhoeae to spectinomycin， azithromycin and cephalosporins in one hospital of Chengdu， Sichuan Province from 2019 to 2021

Wang You-wei， Yang Yang， Zhao Wei， Chen Yuan-wei， Li Hong-xia， Zhang Xin， and Yong Gang

（Department of Laboratory Medicine， Sichuan Provincial Peoples Hospital，

University of Electronic Science and Technology of China， Chengdu 610031）

Abstract Objective To test the susceptibility of Neisseria gonorrhoeae clinical isolates to spectinomycin， azithromycin， and cephalosporins in our hospital from 2019 to 2021， and provide a reference for treatment， prevention， and control of gonorrhea. Methods Clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae were collected and preserved， and the minimum inhibitory concentration （MIC） of spectinomycin， azithromycin， ceftriaxone， and cefixime were determined by the agar dilution method and the broth dilution method， and the drug resistance rate or low sensitivity rate of strains to each drug was analyzed. Results A total of 279 Neisseria gonorrhoeae strains were isolated and collected from 2019 to 2021. There was no spectinomycin-resistant strain. Thirty-one strains were found to be resistant to azithromycin， and the drug resistance rates were 16.00%， 8.82%， and 8.11% from 2019 to 2021， with an average azithromycin-resistance rate of 11.11%.  Forty-three strains were found to be hyposensitive to ceftriaxone， and the hyposensitivity rates were 12.00%， 14.71%， and 18.92% from 2019 to 2021， with an average hyposensitivity rate of 15.41%.  Twenty-seven strains were found to be hyposensitive to cefixime， and the hyposensitivity rates were 4.00%， 2.94%， and 18.92% from 2019 to 2021， and the average hyposensitivity rate was 9.68%.  Two ceftriaxone hypoallergenic and azithromycin resistant strains were found each year， accounting for 2.00%， 2.94%， and 1.80% from 2019 to 2021， and the overall ratio was 2.15%. Conclusion Spectinomycin and ceftriaxone are still suitable as first-line drugs for the treatment of gonorrhea in this region. It is necessary to pay attention to the increasing trend of low sensitivity rate of Neisseria gonorrhoeae to ceftriaxone with each passing year in this region.

Key words Gonorrhea; Neisseria gonorrhoeae; Antimicrobial susceptibility test; Microdilution method; Minimal inhibitory concentration

淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae， NG）简称淋球菌，是淋病的病原菌。关于淋病的治疗，WHO和美国CDC的治疗指南中推荐头孢曲松（ceftriaxone， CRO）与阿奇霉素（azithromycin， AZM）的联合方案，而在我国未将阿奇霉素推荐为治疗淋病的一线药物[1]。近年来，超级淋球菌菌株[2-3]、头孢菌素耐药型（FC428）淋球菌[3-4]，以及对头孢曲松和阿奇霉素双重高度低敏的淋球菌[5-6]的出现，给淋病的治疗带来更大的挑战。淋球菌耐药已成为全球严重的公共卫生问题[7]。本文就2019—2021年四川省人民医院皮肤病性病实验室分离的淋球菌菌株进行大观霉素（spectinomycin， SPE）、AZM以及CRO、头孢克肟（cefixime， CFM）药物敏感性检测，对其检测结果进行总结分析，为淋病的治療和防控提供依据。

1 材料

1.1 菌株来源

检测菌株来自2019—2021年四川省人民医院淋病初诊患者，由本院皮肤病性病实验室分离培养。

1.2 质控菌株

为了每1批MIC检测的质量控制，检测中参加中国疾病预防控制中心性病控制中心组织的淋球菌耐药监测室间质量评价活动。2019年质控菌株编号：19QA1、19QA2、19QA3；2020年质控菌株编号：20QA1、20QA2、20QA3；2021年质控菌株编号：21QA1、21QA2、21QA3

1.3 抗菌药物

本研究选择SPE、CRO、CFM和AZM等4种抗生素，药粉由中国疾病预防控制中心性病控制中心参比实验室提供。

1.4 主要仪器和试剂

VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统、奈瑟菌、嗜血杆菌鉴定卡（NH卡）均用于临床分离初步鉴定菌株的鉴定；GC基础培养基、血红蛋白粉、生长添加剂等均购自英国Oxoid公司，用于T-M选择性培养基和琼脂稀释法药敏培养基的配制；淋球菌药物MIC测试板及其配套稀释液、MH肉汤等，购自珠海金标医学检验技术有限公司（批号：20211124），分别含SPE（药物浓度128～0.06 mg/L）、CRO（药物浓度1～0.0005 mg/L）、AZM（药物浓度8 ～0.004 mg/L）及CFM（药物浓度1～0.0005 mg/L）梯度浓度微孔各12孔，用于微量稀释法药物MIC测定。

2 方法

2.1 菌株的分离培养和保存

采集疑似淋病患者生殖道等部位分泌物样本，采用T-M淋球菌选择性培养基培养24～48 h，得到菌株经革兰染色、氧化酶试验初步鉴定。当氧化酶阳性、革兰染色镜检为阴性双球菌时，增菌后采用奈瑟菌、嗜血杆菌鉴定卡（NH卡）在全自动微生物鉴定系统鉴定。确认后菌株洗脱于30%甘油牛肉浸液保存液中，-80℃冻存备用。

2.2 抗生素液的配制

SPE：称取38.554 mg药粉（纯度：66.4%），溶剂为2 mL注射用纯水，配制成12800 μg/mL原液。将原液倍比稀释呈浓度为6400～400 μg/mL 5个浓度的工作液。

CRO：称取2.160 mg药粉（纯度：92.6%），溶剂为1 mL注射用纯水，配制成2000 μg/mL原液。将原液10倍稀释为200 μg/mL，再倍比稀释得到50～0.8 μg/mL等7个浓度的工作液。

AZM：称取1.691 mg药粉（纯度：94.6%），溶剂为2 mL无水乙醇，配制成800 μg/mL原液。将原液倍比稀释为400～3.125 μg/mL等8个浓度的工作液。

CFM：称取2.024 mg药粉（纯度：98.8%），溶剂为1 mL 0.1 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液，配制成2000 μg/mL原液。将原液20倍稀释至100 μg/mL，再倍比稀释得到50～0.8 μg/mL等7个浓度的工作液。

淋球菌药物MIC测试板已含有梯度浓度的药物，直接使用。

2.3 药敏培养基的配制

在培养皿外底部做好抗生素名及浓度标记，分别吸取抗生素工作液150 μL加入到对应培养皿中，再倾注经高压灭菌冷却至50℃左右的150 mL GC琼脂培养基，混匀，备用。

2.4 菌悬液的配制

冻存细菌采用T-M培养基，在（36℃±1℃）、5%CO2条件下培养时间18～24 h，经过复苏、纯化、增菌等过程，得到细菌经NH卡鉴定后方可使用。将新鲜菌苔洗于预温0.9%生理盐水或MIC测试板配套稀释液中，调整菌液浊度为0.5 CFU/mL，备用。

2.5 最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration， MIC）测定及敏感性判定标准

2019—2020年采用WHO淋球菌耐药监测规划推荐的琼脂稀释法测定MIC[8]。2021年采用微量稀释法测定MIC，测定方法参照淋球菌MIC测试板试剂盒说明书。参照WHO西太平洋地区（简称西太区）淋球菌耐药性监测项目判定标准：大观霉素：Susceptible（S）≤64 mg/L；Resistant （R）≥128 mg/L；阿奇霉素：S≤0.05  mg/L；R≥1 mg/L；头孢曲松：S＜0.125 mg/L；Decreased Susceptible （DS）≥0.125 mg/L。头孢克肟：S＜0.25 mg/L；DS≥0.25 mg/L。

2.6 统计学处理

采用SPSS statistics23统计软件，定量资料比较使用t检验。P<0.05表示具有统计学差异。耐药率、低敏率等使用百分比表述。

3 结果

3.1 一般资料

2019—2021年共检测淋球菌279株。其中254株来源于男性尿道分泌物、1株来源于男性眼部分泌物、23株来源于女性宫颈管分泌物、1株来源于2岁女童外阴分泌物。感染者中男女性别比例10.625：1，年龄最大71岁、最小2岁，平均年龄33.21±11.851岁。男性和女性感染者平均年龄无显著性差异（t=1.973、P=0.050）。男性患者中有22例有同性性行为，占所有男性感染者的8.66%。主诉感染地点主要在本省（98.2%，273/279），有62例患者在一个月内使用过抗菌药物。

3.2 MIC结果

279株淋球菌中未发现对大观霉素耐药的菌株；发现头孢曲松低敏株43株、头孢克肟低敏株27株；发现对阿奇霉素耐药株31株。2019—2021年279株淋球菌对各监测药物MIC结果分布见表1。淋球菌对各监测药物敏感性及MIC50见表2。

3.3 对头孢曲松低敏/阿奇霉素耐药情况

2019—2021年，同時对头孢曲松低敏（MIC≥0.125 mg/L）和阿奇霉素耐药（MIC≥1 mg/L）的菌株数量均为2株，占比分别为2.00%（2/100）、2.94%（2/68）和1.80%（2/111）。淋球菌对头孢曲松低敏率、对阿奇霉素的耐药率以及同时对头孢曲松低敏和对阿奇霉素耐药的比例趋势变化见图1。

4 讨论

本研究在2021年的药物敏感性检测中，使用了微量肉汤稀释法，出现了方法上的不统一，是本文的缺点。2019—2021年，每年参加中国疾病预防控制中心性病控制中心组织的淋球菌耐药监测质量控制计划，结果均满意。

近年来淋球菌对头孢曲松等头孢菌素类药物低敏率和对阿奇霉素耐药性的不断增加，尤其分离到对阿奇霉素高度耐药同时对头孢曲松低敏菌株[9]，或同时对头孢曲松和阿奇霉素高度低敏的菌株[5]，让我们认识到淋球菌全球范围内的耐药现象不容小觑。

本研究显示，2020年和2021年，本院分离淋球菌对阿奇霉素的敏感性基本一致，耐药率分别为8.82%和8.11%，3年总体耐药率为11.11%，低于潘露等[10]报道的浙江地区2016年的20.48%，和广州地区2018年的16.15%[11]。与广西北海地区2015—2019年[12]、浙江部分地区2013—2018年[13]耐药率逐渐增加的情况相反，与赵静[15]介绍的从2014—2018年逐年降低类似，本院2019—2021年分离淋球菌对阿奇霉素的耐药率从2019年的16.0%[14]呈逐年降低趋势。据不完全统计，2021年就诊患者中，22例患者在一个月内有服用以左氧氟沙星、头孢菌素类药物等为主的抗生素，没有1例使用过阿奇霉素。本院淋球菌对阿奇霉素耐药率的降低是否与本地区医生的习惯性用药[16]以及患者对于抗生素的可获得性等因素有关应做进一步的研究。

本院分离获得的淋球菌对头孢曲松低敏率在2019、2020和2021年分别为12.00%（12/100）、14.71%（10/68）和18.92%（21/111），低敏菌株的流行与我国台湾地区[17]报告的趋势一致，总低敏率为15.4%，低于浙江部分地区2018年报道的18.58%[13]、较江苏地区2017—2018年的7.64%[18]高。2021年111株淋球菌对头孢克肟敏感性显著性降至81.98%，有12株菌的MIC≥1 mg/L，且均为头孢曲松低敏菌株，与黎小东等[19]报道的敏感率81%相似。

本院分离获得的淋球菌对阿奇霉素的耐药率呈下降趋势，且在2020—2021年间相对稳定，对头孢菌素类药物低敏率呈上升趋势，且对头孢克肟的敏感性降低，两者趋势呈现剪刀叉形态。对头孢菌素类药物低敏和对阿奇霉素耐药的菌株数量和比率没有明显变化。这种趋势与在美国2014—2018年间头孢克肟耐药率下降、阿奇霉素耐药率上升；在欧洲2014—2018年间头孢克肟、阿奇霉素耐药率都上升；在澳大利亚和加拿大，头孢曲松低敏/耐药率下降与阿奇霉素耐药率呈上升[20]的趋势均不同，与我国广州市2013—2018年阿奇霉素耐药上升的趋势[21]也相反。从部分患者自行服用左氧氟沙星等现象来看，笔者认为：出现上述趋势，与当地的经济水平、就医行为、临床认知和宣传教育等相关。应加大淋病防治的宣传教育，促进患者及时、规范就医；加大淋球菌耐药监测数据的临床应用，指引和提升临床用药的科学性和准确性；提升全社会对抗生素耐药会带来的感染风险、医疗成本和社会防治成本增加[22]的认识，促进抗生素合理运用。

我国治疗淋病的推荐方案是头孢曲松或大观霉素作为一线药物单次给药[1]。本研究显示大观霉素和头孢曲松适合本地区作为治疗淋病的一线药物，但随着头孢菌素类药物低敏率的增加，应加大淋球菌对抗生素敏感性检测和监测力度，开展淋球菌耐药机制研究和新药开发、老药新用探索，实施全社会多维度的淋病防治策略[23]。

参 考 文 献

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