不同活化方法修饰碳电极检测红油中辣椒素含量的电化学研究

陆超群，陈星光，恽 宁，顾千辉,

（1.三只松鼠股份有限公司，安徽芜湖 241000；2.江南大学食品学院，江苏无锡 214000；3.南昌大学食品学院，江西南昌 330000）

辣椒素类物质（Capsaicinoids）是辣椒碱类化合物的总称，是从辣椒植物果实中得到的活性成分，其特点为辛辣[1-2]，因具有感官刺激性，常作为一种非常重要的食品添加剂在世界各地广受欢迎[3]。其中辣椒素是其主要活性成分，具有调味、清除自由基、抗氧化、抗癌等活性[4-8]，在食品与医药领域被广泛关注。在我国，因独特的食辣文化，辣椒在川菜等菜品中广泛应用，其中红油作为一种为食品提供色，香，味的重要辣椒制品，广泛应用于酱卤肉制品、小吃、火锅等领域，成为人们饮食生活中的重要组成部分，而辣椒素的含量常被用于描述辣椒、红油等辣味产品的辛辣程度[9-10]。

辣椒素含量常用的测定方法有比色法[11]、高效液相色谱法[10]以及液相色谱质谱联用法[12]等。比色法操作繁琐、费时，准确度和灵敏度不高。高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法则具有检测稳定、准确性高的特点，常作为判定方法使用，但缺点是仪器昂贵，操作专业性强，检测周期长[13-14]，不适合工厂在线检测。电化学分析方法是一种根据待测物质的电化学活性及其变化规律，建立以电流、电位及电量等物理量与待测物的计量关系，从而对组分进行定性或定量的仪器分析方法[15]，因其经济易行、灵敏度高、实用性强等特点，成为研究的热门领域之一。Yang 等[16]采用金磁微粒（GMP）修饰丝网印刷电极，利用Au-S 共价结合力在电极表面通过牛血清白蛋白富集检测克伦特罗，其检测限可达 0.22 ng/mL。Patricia 等[17]等用羧基化单壁碳纳米管（SWNTCOOH）、CeO2以及十六烷基吡啶溴化物（CPB）修饰的玻碳电极（GCE）传感器用于辣椒素含量检测，检测限可以达到0.028 μmol/L。这些传感器的特点是检测限低、灵敏度高，但传感器制备工艺较复杂，需要通过大量实验筛选合适的传感器材料，具有一定技术难度，且成本取决于所用材料的价格高低，不利于实际应用，因此研究简单易制备的传感器具有一定价值。

本研究采用不同规格玻碳电极、石墨电极等碳基电极作为检测材料，研究酸、碱、盐活化方法对不同碳电极检测辣椒素类物质含量的影响，制备活化碳电极传感器，用于检测红油中辣椒素类物质的含量，比传统电化学传感器制备简单，在辣椒素检测领域尚无相关研究报道。并利用扫描电镜、拉曼光谱等手段表征其活化过程微观结构变化，从微观结构角度解析活化电极检测辣椒素原理机制，相关研究内容尚未有报道出现。通过该方法构建的电化学传感器具有简单、快速、低成本的特点，可用于红油中辣椒素物质含量的快速检测，为红油类产品辣度评价、产品稳定提供可行性方案参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蜀香红油 将天鹰椒与小米辣2 种辣椒炒制后打磨成粉（50 目），按1:1 比例取20 g 辣椒粉，加入150 ℃烧热的大豆油180 g，边加边搅拌至温度降至60 ℃以下，常温下密封静置20 h 后待用；辣椒素标品 纯度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司；二氢辣椒素标品、N -壬酸香草酰胺 纯度≥95%，均采购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；盐酸、硫酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、无水甲醇、铁氰化钾、亚铁氰化钾、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、氢氧化钠 均为分析纯，采购自国药集团；实验室用水 均为超纯水（18.2 MΩ·cm）；实验中使用溶液均为实验前现配。

CHI660D 型电化学工作站 海辰华仪器有限公司；三电极系统 上海仙仁仪器有限公司：石墨电极（Φ=2 mm ）、玻碳电极（Φ=2 mm 和3 mm）为工作电极，铂盘电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极；MPLK-701 型数显控温磁力搅拌器 常州市金坛大地自动化仪器厂；ME55 电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FiveEasy Plus pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；VELOCITY 14R 型高速冷冻离心机 南京茜美生物技术有限公司；DZF-6050AB 型真空干燥箱 上海力辰邦西仪器科技有限公司；KQ3200DA 型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；UPT-II-10T 超纯水机 四川优普超纯科技有限公司；GeminiSEM 560 扫描电子显微镜 德国卡尔蔡司股份有限公司；Sigma300 X 射线能谱仪 德国卡尔蔡司股份有限公司；LCMS-5500 液质联用仪 沃特世科技（上海）有限公司；LabRAM HR800 拉曼光谱仪 法国HORIBA Jobin Yvon 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 活化电极的制备 采用三种不同的电化学方法，对打磨后的石墨电极（Φ=2 mm），玻碳电极（Φ=2 mm，3 mm）进行活化处理：

酸活化[18-19]：以0.5 mol/L 的硫酸溶液为电解液，采用循环伏安法（CV）对以上电极进行酸活化，活化条件为电位范围-0.3～2.0 V，扫描速度0.1 V/s，扫描圈数20 段；

碱活化[20-21]：以1 mol/L 的NaOH 溶液为电解液，采用循环伏安法对以上电极进行碱活化，活化条件为电位范围-0.5～1.2 V，扫描速度0.1 V/s，扫描圈数20 段；

磷酸盐活化[22-23]：以0.2 mol/L 的磷酸盐溶液为电解液，采用循环伏安法对以上电极进行磷酸盐活化，活化条件为电位范围-2.0～2.2 V，扫描速度0.1 V/s，扫描圈数20 段，pH5.0。

1.2.2 活化电极检测辣椒素效果比较 选择石墨电极（Φ=2 mm），玻碳电极（Φ=2 mm，3 mm）作为工作电极，采用循环伏安脉冲法和溶出伏安脉冲法（DPAdSV）检测含有26.20 μmol/L 辣椒素的0.1 mol/L盐酸电解液，研究了辣椒素在活化电极上的电化学行为。CV 的初始参数：电位范围为0～1 V，扫描速率为0.1 V/s，灵敏度1.0×10-4A/V。DP-AdSV 的初始参数：沉积时间120 s，沉积电压0.1 V，电位范围为0.2～0.9 V，脉冲振幅为0.05 V，脉冲宽度为0.2 s，脉冲周期为0.4 s，平衡时间为2 s[24]。

1.2.3 活化条件对检测辣椒素含量的影响 以石墨电极为工作电极、辣椒素检测电流值为指标，研究磷酸盐活化条件对石墨电极检测辣椒素含量的影响，设置参数为：在pH6，电位条件-1.0～2.2 V，活化时间10 段条件下，考察磷酸盐溶液浓度（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）的影响；在电解质溶液浓度为0.2 mol/L，电位条件-1.0～2.2 V，活化时间10 段条件下，考察pH（3、4、5、6、7、8）的影响；在电解质溶液浓度为0.2 mol/L，pH5，活化时间10 段条件下，考察活化电位（-1.5～2.2，-1～2.2，-2～2.2，-2～1.6，-2～1.0 V）的影响；在电解质溶液浓度为0.2 mol/L，pH5，电位条件-2～2.2 V，考察活化时间（5、10、20、30、40 段圈数）的影响，检测辣椒素的电解液为0.1 mol/L，pH 为1 的盐酸溶液。

1.2.4 活化电极检测辣椒素电化学机制研究 0.1 mol/L，pH 为1 的盐酸溶液作为电解液，采用不同的扫描速率（25、50、100、200 和300 mV/s）对5 mmol/L 铁氰化钾溶液进行CV 表征，CV 扫描条件为电位范围为-0.2～0.6 V，扫描速率为0.1 V/s，灵敏度1.0×10-4A/V。对含26.20 μmol/L 辣椒素的盐酸溶液进行CV 扫描，参数条件为电位范围为0～1 V，扫描速率为0.1 V/s，灵敏度1.0×10-4A/V[24]。

用0.10 mol/L 的盐酸溶液作为pH1 的支持电解液，用PBS 溶液用于pH3～7 的支持电解液，使用CV 法在不同的pH（1、3、4、5、6、7）条件下对含49.12 μmol/L辣椒素的盐酸溶液进行CV 扫描。扫描参数条件的电位范围为0～1 V，扫描速率为0.1 V/s，灵敏度1.0×10-4A/V。

1.2.5 电极活化结构表征 在最优条件下磷酸盐活化石墨电极，活化后的电极在50 ℃下真空干燥至表面干燥无水分，采用扫描电子显微镜搭配X 射线能谱仪研究磷酸盐活化石墨电极前后的微形貌及碳，氧，磷元素变化，仪器设置参数：加速电压（EHT）为10 KV、测试倍数（mag）为10000 倍、工作距离（WD）为10.6 mm，积分时间10 s。采用拉曼光谱仪检测磷酸盐活化前后石墨电极表面的材料晶体缺陷特征情况，设置拉曼位移为500～2500 cm-1。

1.2.6 加标回收率检测 标准曲线制备：使用活化电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系检测不同辣椒素浓度（5、10、20、40、80 μmol/L），每个样本检测3 次以上取平均值，检测方法使用溶出伏安脉冲法，DP-AdSV 的参数条件[24]：沉积时间120 s，沉积电压0.1 V，电位范围为0.2～0.9 V，脉冲振幅为0.05 V，脉冲宽度为0.2 s，脉冲周期为0.4 s，平衡时间为2 s。根据IUPAC提供的方法计算出活化电极对辣椒素的检测限[25]。

加标回收率检测：取2～5 g 红油入大烧杯中，向烧杯中加入15 mL 无水甲醇，在60 ℃条件下超声（100 W）30 min 后，采用10000 r/min 离心10 min，收集上清液。沉淀重复提取两次，并将所有滤液一起收集，用无水甲醇溶液将提取液定容至50 mL 备用。提取液用0.22 μm 有机滤膜进行过滤后，加入不同浓度（5、20、40 μmol/L）的辣椒素标准溶液，每个浓度制备3 个平行样品，采用DP-AdSV 法检测3 次。将测得的响应电流值代入标准曲线中，计算得出辣椒素含量及加标回收率。

国标法对比：上述提取液经0.22 μm 有机膜过滤，参考国标法[12]采用液相色谱-质谱法（LC-MS）检测红油中辣椒素含量并进行加标回收率计算。LCMS 测试条件为：扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：350 ℃；雾化气压力：207 kPa（30 psi）；干燥气流量：9 L/min；毛细管电压：4000 V。

1.2.7 抗干扰性及稳定性检测 将味精（80.20 μmol/L），蔗糖（43.82 μmol/L）和无机盐离子（256.41 μmol/L Mg2+，K+，Na+，Cl-和SO42-）分别添加到终浓度49.12 μmol/L 辣椒素溶液中，采用DP-AdSV 检测掺杂辣椒素溶液考察活化电极的抗干扰性能。将石墨电极活化后抽真空密封并存放在4 ℃条件下，在0，1，2 d 分别检测20 μmol/L 辣椒素电解质溶液，评价其稳定性。

1.3 数据处理

以上实验均测定三次，结果以平均值±标准差表示，运用SPSS 18.0 软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析进行显著性差异分析，P＜0.05 认为具有显著性，实验数据图利用 Origin 2018 软件绘制。

2 结果与分析

2.1 不同活化电极对辣椒素检测的影响

选择石墨电极（Φ=3 mm），玻碳电极（Φ=2 mm，3 mm）作为工作电极，采用循环伏安法检测含有26.20 μmol/L 辣椒素的0.1 mol/L 盐酸电解液，考察不同活化方式对检测辣椒素效果的影响。结果如图1 所示，在磷酸盐活化（A）、碱活化（B）和酸活化（C）中，石墨电极检测辣椒素的电流值均最大，其次为Φ=3 mm 玻碳电极，Φ=2 mm 玻碳电极电流值最小，因此选择检测响应最高的石墨电极作为传感器碳材料。图1D 是酸、碱、盐活化后的石墨电极检测辣椒素的效果比较，结果显示活化后的检测数值显著增大，推测是电极经活化后表面引入了含氧基团，形成分子间氢键，提高了电极性能，使得辣椒素大量在电极表面被催化氧化，电子传递能力增强[23]。三种活化方式中，磷酸盐的活化效果最好，辣椒素检测数值最高，其次是碱活化方式，酸活化方式响应值最小，故选择磷酸盐活化作为检测辣椒素的最佳活化方式。

图1 磷酸盐活化（A），碱活化（B），酸活化（C）对不同电极的活化效果及不同活化方式的效果比较（D）Fig.1 Activation effects of phosphate activation (A), base activation (B), and acid activation (C) on different electrodes and the comparison of the effects of different activation modes (D)

2.2 磷酸盐活化条件对检测辣椒素含量的影响

图2A～图2D 分别为磷酸盐浓度、pH、活化电位和活化时间（圈数）对石墨电极检测辣椒素含量的影响，结果显示在一定范围内，随磷酸盐浓度增加、pH 增大，电流值均为先增加后降低，磷酸盐浓度在0.05～0.3 mol/L 范围内无显著性差异，而浓度为0.4 mol/L 时活化效果显著降低（P＜0.05），当pH 为碱性时活化效果明显下降，这与王长芹等[26]、李金金等[27]、马榕等[28]学者报道的趋势一致，也与课题组前期研究结果相近，均是在碱性条件下效果逐渐下降[24]，最优pH5.0，最佳磷酸盐浓度为0.2 mol/L。电位结果显示磷酸盐的活化对检测影响显著，最佳活化电位为-2.0～2.2 V，其余电位均会导致检测值显著下降。当活化时间超过20 段后磷酸盐活化石墨电极检测辣椒素的数值无显著变化，采用活化20 段作为最优活化时间。综上最优活化条件为磷酸盐浓度0.2 mol/L、pH5.0、电位范围-2.0～2.2 V、扫描段数20。

图2 不同磷酸盐浓度（A），pH（B），电位条件（C），活化时间（D）条件对石墨电极检测辣椒素的影响Fig.2 Influence of different phosphate concentrations (A), pH (B),potential conditions (C), and activation time (D) on the determination of capsaicin with graphite electrode

2.3 扫描速度对磷酸盐活化石墨电极检测辣椒素的影响

为了获得参与电化学反应的电子数，在不同的CV 扫描速率下分别扫描5 mmol/L 铁氰化钾溶液和26.20 μmol/L 辣椒素溶液。图3A～图3B 为不同扫速条件下活化电极在铁氰化钾中的电化学行为，从图中可得随着扫速的增加铁氰化钾峰电流逐渐增大，且氧化峰电流与扫速的平方根成正比，还原峰的峰电流与扫速的平方根成反比。图3C～图3D 为不同扫速条件下活化电极在辣椒素中的CV 表征，结果显示，随着扫速的增加辣椒素检测峰电流逐渐增大，氧化还原峰的峰电流与扫速的平方根成线性关系，表明辣椒素在活化电极表面的催化反应主要受扩散控制，根据巴特勒-沃尔默方程[29]，经计算磷酸盐活化石墨电极检测辣椒素参与电化学反应的电子数为2。

图3 不同扫速下磷酸盐活化石墨电极在铁氰化钾溶液（A，B）和辣椒素（C，D）中的电化学行为Fig.3 Electrochemical behavior of phosphate-activated graphite electrodes in potassium ferricyanide solution (A, B) and capsaicin (C, D) at different sweeps

2.4 pH 对活化石墨电极检测辣椒素的影响

为了获得参与电化学反应的质子数，使用CV法在不同的pH（1、3、4、5、6、7）下扫描49.12 μmol/L辣椒素溶液。如图4 所示，随着pH 的增大，活化电极检测辣椒素的响应值逐渐减小，电解液pH7 时，辣椒素响应值几乎为零，检测辣椒素最佳支持电解液pH1。且结果显示检测峰电位与pH 成线性反比关系，曲线斜率为46 mV/pH，参考文献[29]方法经计算，活化电极检测辣椒素过程中参与电化学反应的质子数为1。

图4 磷酸盐活化石墨电极在不同pH 中检测辣椒素的循环伏安扫描表征（A）和电位、pH 的线性关系（B）Fig.4 Characterization of the CV behavior of capsaicin on phosphate-activated graphite electrodes in different pH (A) and linear relationship between potential and pH (B)

2.5 磷酸盐活化石墨电极结构表征

磷酸盐活化石墨电极的电镜扫描结果如图5 所示，图5A～图5B 和图5C～图5D 分别为SEM 表征下1 和10 μm 扫描图，由图可知，磷酸盐活化石墨电极对电极表面微观结构未产生明显改变（图5A～图5B），仅有部分磷酸盐会电沉积在石墨电极表面形成白色结晶（图5C～图5D）。为进一步考察磷酸盐活化石墨电极前后表面元素含量的变化，实验采用能谱仪（ EDS） 进行了测试，结果如图5E 和图5F 所示。与磷酸盐活化前相比，活化后的石墨电极表面的碳元素质量百分比从99.2%减少至57%，而氧含量从约0.8%增加至 34.9%，磷元素由0%增加至8.1%。通过结果对比推测这种变化是由于石墨电极表面在磷酸盐溶液中电化学活化所致，由此可推测磷酸盐活化后的石墨电极检测辣椒素电流值增大是因为活化后增加了电极表面的含氧活性元素含量。

图5 磷酸盐活化石墨电极前（A, C, E）后（B, D, F）结构SEM+EDS 表征Fig.5 SEM+EDS characterization of the structure before (A, C,E) and after (B, D, F) the phosphate-activated graphite electrode

图6为磷酸盐活化石墨电极前后的拉曼图，其中D-峰代表的是C 原子晶的缺陷，G-峰代表的是C 原子sp2 杂化的面内伸缩振动，活化前复合物的ID/IG（0.90）值高于活化后 ID/IG（0.72），说明活化前比活化后有更多的缺陷位点，也进一步证实了石墨电极经磷酸盐电化学活化后发生了氧化还原反应，表面基团被氧化，含氧活性基团增多[26]。

图6 磷酸盐活化石墨电极前后拉曼光谱检测Fig.6 Raman spectroscopy detection before and after phosphate-activated graphite electrodes

2.6 加标回收率检测

如图7 所示，活化石墨电极检测辣椒素的线性方程为Ipa（μA）=0.5804C（μmol/L）-1.307，R2值为0.9996，检测限为2.30 μmol/L。利用国标法[12]《GB/T 40348-2021》提取蜀香红油中的辣椒素含量，同时采用磷酸盐活化的石墨电极及LCMS 检测辣椒素含量，得出红油样品中辣椒素含量分别为118.10 mg/kg与107.62 mg/kg，误差9.7%在可接受范围内。如表1所示，电化学方法加标回收率为98.23%～112.60%，LC-MS 方法加标回收率为92.45%～100.77%，磷酸盐活化石墨电极检测红油中辣椒素含量具有方法可行性。

表1 红油中不同辣椒素浓度加标回收率检测比较Table 1 Comparison of standard addition recovery experiments of different capsaicin content in red oil

图7 磷酸盐活化石墨电极检测辣椒素标准曲线Fig.7 Standard curve of capsaicin detection by phosphateactivated graphite electrode

2.7 抗干扰性和稳定性

通过向辣椒素溶液中添加产品中常见的蔗糖，无机盐离子，味精等干扰物考察活化电极检测辣椒素的抗干扰性，结果如图8A 所示，添加干扰物对辣椒素的响应值影响相对于空白组在±5%以内，表明产品中常见的干扰物对活化电极无显著影响，磷酸盐活化石墨电极检测红油中辣椒素含量具有较好的抗干扰性。如图8B 所示，磷酸盐活化石墨电极存放2 d后检测辣椒素的电流值显著（P＜0.05）下降，但存放1 d后检测辣椒素的数值仅下降4.3%，表明磷酸盐活化电极短时间内具有一定的稳定性。

图8 活化石墨电极检测辣椒素的抗干扰性（A）和稳定性（B）Fig.8 Anti-interference properties (A) and stability of capsaicin(B) detected using activated graphite electrodes

3 讨论

电化学检测方法具有灵敏度高、实用性强等优势，但其传感器制备非常依赖材料的选择，选择工艺成熟、成本低廉的材料作为传感器具有一定实用价值。通过分析发现，适合作辣椒素电化学检测的传感器主要由碳纳米管、石墨等碳材料经过修饰改性而来[24,29-31]，如Xu[24]利用碳纳米管与环糊精修饰的玻碳电极检测酱卤肉制品中辣椒素含量，检测限达到0.29 μmol/L，加标回收率为83.2%～136.26%，具有较强的抗干扰性、重现性和稳定性。本文研究结果也证实采用磷酸盐活化石墨电极构建传感器可以用于检测红油中辣椒素含量，检测限2.30 μmol/L，加标回收率为98.23%～112.60%，虽然检测限相比较已有碳材料传感器[24]未能显著提高，但制备成本及稳定性优势显著。

常规裸电极材料检测辣椒素的数值较小，达不到检测效果[7]，但进行电化学活化后可以显著提高检测数值，本研究中采用酸、碱、盐活化前后的数值分别增大4.9、8.6、11.2 倍，活化效果显著，与金赛燕等[22]利用氨基甲酸铵和磷酸盐缓冲液（PBS）复合活化裸玻碳电极检测尿液中的多巴胺和尿酸提升效果相近。通过结果可见磷酸盐浓度与活化效果并不是绝对的正比关系，当磷酸盐浓度过高时（≥0.4 mol/L）活化效果反而显著下降，通过扫描电镜观察到电极表面会存在磷酸盐附着现象（图5D），由此推测磷酸盐浓度过高时会在电极表面附着大量磷酸盐使电极活性位点无法暴露出来，从而使活化效果下降。

前期研究表明，以碳材料为主的传感器检测辣椒素的机制为扩散控制的准可逆氧化还原反应，通过捕获辣椒素氧化还原反应过程产生的转移电子达到检测目的[24-25]。通过研究磷酸盐活化的石墨电极检测辣椒素的电化学行为，该传感器检测辣椒素的电化学行为与前期研究一致，表明碳材料在检测辣椒素过程中具有相同或相似的反应过程和原理。反应过程有电子和质子参与，其中电子数为2、质子数为1，结合辣椒素本身属于酰胺类化合物的结构，反应路径可能为酸性条件下的辣椒素氧化成邻苯醌，邻苯醌和儿茶酚之间发生可逆的还原氧化反应[32-33]。进一步研究显示，电极表面在活化前后发生了显著变化，含氧基团含量显著提升，表明磷酸盐活化引入的含氧基团，是电极活性提升、检测效果增强的微观原因。

本文与前期研究显示辣椒素的检测特征峰均出现在0.4～0.5 V 的位置，具有一定特征性，研究发现其主要与碳材料及盐酸电解液有关[24-25,34]。采用该方法检测红油中辣椒素含量，与液质联用检测结果相近，具有方法可行性。但相比较其他碳材料传感器[17,24-25,34]，该方法的检测限明显偏高，表明该方法具有一定局限性，不适用于辣椒素含量过低的产品，但对于红油等富含辣椒素物质的产品具备实用性。

4 结论

综上所述，构建磷酸盐活化的石墨电极传感器可用于红油中辣椒素含量的准确、快速检测，在0.2 mol/L 磷酸盐浓度、pH5.0、电位-2.0～2.2 V、活化时间20 段的最优条件下，活化前后检测数值提升11.2 倍，检测结果与液质联用相比误差小于10%，具有良好的抗干扰能力与稳定性。通过微观结构研究，磷酸盐活化使石墨电极含氧基团含量增加，增加了电极活性，提高了检测辣椒素的灵敏度。虽然与其他碳电极比较存在检测限较高的局限，但方法简单可靠、成本较低，便于后期推广应用，可以作为检测红油中辣椒素含量的一种有效检测手段，如何运用该方法用于红油生产过程的在线检测将是下一步研究方向之一。