张泽家,杨小琴,高庆和,陈豪特,丁家森,刘剑刚,高瞻
中国中医科学院西苑医院,北京 100091
Ⅲ型前列腺炎是一种以长期、反复骨盆区域疼痛不适,可伴有不同程度排尿症状及性功能障碍为主要临床表现的疾病,严重影响患者生活质量[1]。研究显示,免疫因素在Ⅲ型前列腺炎的发生发展过程中发挥重要作用[2]。中国中医科学院西苑医院高瞻教授基于“内痈”理论及临床经验拟定的益气活血托毒方能显著缓解Ⅲ型前列腺炎患者临床症状,降低慢性前列腺炎症状评分,减少患者前列腺液中炎症因子表达[3],但其作用机制尚未完全明确。课题组前期研究发现,益气活血托毒方与Ⅲ型前列腺炎的交集靶点主要富集在核转录因子-κB(NF-κB)通路上,故预测益气活血托毒方可能通过降低前列腺组织炎症因子水平,阻止其下游NF-κB抑制物激酶(IKKs)磷酸化及NF-κB抑制蛋白α(IκBα)与NF-κB二聚体解离,从而抑制NF-κB进入细胞核内催化炎症因子产生和激活免疫反应。目前认为,Ⅲ型前列腺炎发病与自身免疫关系密切,自身免疫性前列腺炎(experimental autoimmune prostatitis,EAP)小鼠模型是研究Ⅲ型前列腺炎的标准动物模型之一[4]。基于此,本研究应用前列腺蛋白提纯液联合弗氏完全佐剂建立EAP小鼠模型,观察益气活血托毒方对EAP小鼠前列腺组织病理变化、炎症反应及免疫功能等方面的影响,探讨其治疗Ⅲ型前列腺炎的作用机制。
SPF 级8 周龄C57BL/6 雄性小鼠60 只,体质量(23±2)g,8 周龄雄性SD 大鼠10 只,体质量(180±20)g,斯贝福(北京)生物技术有限公司提供,动物生产许可证号SCXK(京)2019-0030,合格证号110324211104281256。饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级动物房,温度(24±2)℃、湿度50%~70%环境,动物使用许可证号SYXK(京)2018-0018。本实验经中国中医科学院西苑医院伦理委员会审批(2021XLC043-2)。
益气活血托毒方由黄芪30 g、党参15 g、丹参15 g、川芎10 g、白术10 g、茯苓10 g、熟大黄6 g组成,由中国中医科学院西苑医院制剂室制成浸膏,每克浸膏含原药材2.5 g。盐酸坦索罗辛缓释胶囊,0.2 mg/粒,江苏恒瑞医药股份有限公司,临用前取胶囊内容物,用蒸馏水配制成0.65 μg/mL溶液。
弗氏完全佐剂(美国Sigma,批号SLCB9716),0.5%Triton X-100(上海碧云天生物技术有限公司,批号120320210616),BCA蛋白试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,批号122120210520),小鼠免疫球蛋白IgG/A/M试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号20220105BH),血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)试剂盒(北京欣博盛生物,批号分别为20220105X、20220106X),p-NF-κB p65、IL-1β抗体(英国Abcam 公司,批号分别为ab86299、ab283818),p-IKK-β、TNF-α抗体(美国GeneTex公司,批号分别为GTX52310、GTX110520)。
MultiSkan3 型酶标仪,美国Thermo 公司;EG1150型病理包埋机,德国Leica公司;7160型全自动生化仪,日本Hitachi公司;DR-200BS型全自动酶标分析仪,无锡华卫德朗仪器有限公司;Mini P-4型电泳槽、湿转电泳槽,北京凯元信瑞仪器有限公司;PowerPac型电泳仪,美国Bio-Rad公司。
取10只大鼠,常规饲养7 d,3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉,取前列腺,放入冰生理盐水中,去除脂肪、膀胱等组织,清洗3~5次,剪碎,加入含0.5% Triton X-100的生理盐水,冰浴匀浆,4 ℃、15 000 r/min离心30 min[4],去除上层脂肪组织,取上清液,即得前列腺蛋白提纯液,放入冻存管,-20 ℃保存备用。临用前用BCA法测定蛋白浓度,根据蛋白浓度用0.01 mmol/L PBS将蛋白提纯液稀释至15 mg/mL。
取50只小鼠,肌肉注射氯胺酮(4~6 mg/kg)麻醉,在小鼠双侧脚掌、双侧腹股沟及颈部共5处皮下注射0.1 mL前列腺蛋白提纯液与0.1 mL弗氏完全佐剂的混合液[4-5]。造模0、15、30 d 各注射1 次。造模15、22、30 d各随机选取2只小鼠,取前列腺组织进行病理检测,观察炎症进展情况。造模45 d随机选取4只小鼠,取前列腺组织进行病理检测,若见黏膜皱襞消失,腺上皮破坏,间质明显肿胀、模糊,有大量炎症细胞浸润,表明模型制备成功[4]。
将造模成功的40只小鼠随机分为模型组、西药组和中药低、高剂量组,每组10只。另取10只小鼠作为空白组。造模成功次日开始给药,中药低剂量组按人与小鼠等效剂量换算[6],益气活血托毒方浸膏4.8 g/kg,高剂量组剂为9.6 g/kg,西药组予0.65 μg/mL盐酸坦索罗辛溶液灌胃,灌胃体积0.4 mL/只,模型组和空白组予等体积饮用水灌胃,每日1次,连续4周。
1.7.1 小鼠一般状况
造模及给药期间,观察小鼠生活状态及体征,造模期间每15 d记录1次体质量,给药期间每2周记录1次体质量。
1.7.2 血清炎症因子和免疫因子检测
给药结束后,肌肉注射氯胺酮麻醉,眼球取血,4 ℃、2 500 r/min离心10 min,取血清,根据ELISA试剂盒说明书操作,酶标仪检测吸光度,根据标准曲线计算血清TNF-α、IL-1β、IgA、IgG、IgM含量。
1.7.3 前列腺组织病理观察
末次给药后24 h脱颈处死小鼠,分离前列腺组织,于10%福尔马林溶液固定72 h后石蜡包埋,组织切片,37 ℃烤片12 h,脱蜡复水,HE染色后封片,光镜下观察前列腺组织病理变化。
1.7.4 Weston blot检测蛋白表达
取前列腺组织,以组织质量∶裂解液体积=1∶9比例加入RIPA裂解液,15 000 r/min匀浆,每次10 s,间隔10 s,重复3次。冰孵20 min,4 ℃、13 000 r/min离心20 min,取上清液,BCA法测定蛋白浓度,以RIPA裂解液调整蛋白浓度,加入5×上样缓冲液,使蛋白终浓度为4 mg/mL,煮沸变性5 min。5%浓缩胶电泳,恒压90 V、20 min,12%分离胶,恒压160 V,通过预染蛋白marker确定电泳停止时间。300 mA转至NC膜。3%BSA 封闭,加入p-NF-κB p65 一抗(1∶1 000)、p-IKK-β一抗(1∶1 000)、TNF-α一抗(1∶2 000)、IL-1β一抗(1∶1 000),4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜,加入HRP-山羊抗兔IgG(1∶10 000)孵育1 h,洗膜,ECL显影。以β-actin为内参,Total Lab Quant 11.5读取积分光密度。
采用GraphPad Prism 8.3.0统计软件进行数据处理和分析。计量资料用xˉ±s表示,数据符合正态分布且方差齐用方差分析,不满足正态分布或方差不齐用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
模型组小鼠第1次皮下注射前列腺蛋白提纯液+弗氏完全佐剂后活力明显减弱,可见皮丘逐渐吸收。至注射后第14日,活力基本恢复,烦躁情绪明显,尿量明显增加,部分小鼠有未吸收皮丘。第2次皮下注射后活力较前明显减弱,尿量稍有减少,可见明显未吸收皮丘。西药组及中药高、低剂量组小鼠一般状况均较模型组有所改善。
与空白组比较,模型组小鼠造模15 d体质量差异无统计学意义(P>0.05),造模30、45 d小鼠体质量明显减少(P<0.01)。与模型组比较,中药低、高剂量组及西药组小鼠给药14 d体质量明显增加(P<0.05,P<0.01),中药高剂量组小鼠给药28 d体质量高于西药组和中药低剂量组。见图1。
图1 各组小鼠造模和给药期间体质量变化(±s,每组10只)
与空白组比较,模型组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IgA、IgG、IgM含量明显升高(P<0.01);与模型组比较,中药低、高剂量组和西药组小鼠血清TNF-α、IL-1β含量明显降低(P<0.05,P<0.01),中药高剂量组小鼠血清IgA、IgG、IgM含量明显降低(P<0.05,P<0.01)。见图2、图3。
图2 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β含量比较(±s,每组10只)
图3 各组小鼠血清IgA、IgG、IgM含量比较(±s,每组10只)
与空白组比较,模型组小鼠前列腺腺体周围可见散在炎症细胞,腺体显著扩张、增大,腺腔内大量粉红色分泌物,腺上皮呈扁平状,间质水肿明显;西药组小鼠腺体周围间质散在炎症细胞浸润,腺腔中等、大小不一,腔内有分泌物,腺上皮厚薄不一、呈扁平状,黏膜皱襞结构正常,间质可见水肿;中药低剂量组小鼠腺体周围间质未见明显炎症细胞浸润,或极少量炎症细胞浸润,腺腔偏小、大小不一,腔内有少量分泌物,腺上皮偏厚,多数黏膜皱襞结构正常;中药高剂量组小鼠腺体周围间质未见明显炎症细胞浸润,或极少量炎症细胞浸润,腺腔大小均匀,腺上皮较厚,黏膜皱襞结构正常。见图4。
图4 各组小鼠前列腺组织形态(HE染色,×10)
与空白组比较,模型组小鼠前列腺组织p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显升高(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,中药高剂量组小鼠前列腺组织p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显降低(P<0.01,P<0.05)。见图5、图6。
图5 各组小鼠前列腺组织p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白免疫印迹
图6 各组小鼠前列腺组织p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表达比较(±s,每组10只)
Ⅲ型前列腺炎属中医学“精浊”“尿频”等范畴[7],其病因主要与外感六淫、饮食不节、房劳过度、久立久坐等相关[8]。湿、热、瘀、虚贯穿本病始终,临床证型以复合型为主[9]。课题组前期观察发现,本病患者存在气虚血瘀的病机基础,应用益气活血托毒方益气活血、托毒外出,临床疗效显著[3,10]。益气活血托毒方在四君子汤基础上,以党参易人参,补脾益气;黄芪为“补气圣药”,与党参协同,益气健脾,共为君药,同时黄芪可托毒排脓,发挥“补托”之功。丹参活血化瘀生新,川芎活血行气,二者一寒一温,调和药性,共为臣药。白术、茯苓补气健脾、燥湿利水,改善排尿症状,共为佐药。熟大黄逐瘀通经、凉血解毒、引药入经,为使药。全方配伍契合Ⅲ型前列腺炎病机特点,扶正祛邪,从而起到改善和逆转前列腺炎炎性改变的作用。
前列腺组织病理观察是评价EAP模型的主要指标,本实验可见模型组小鼠前列腺腺体周围散在炎症细胞,腺体显著扩张、增大,腺腔内大量分泌物,腺上皮呈扁平状,间质水肿明显,符合模型标准[4]。经药物干预后,西药组和中药低、高剂量组均有不同程度改善,其中中药高剂量组改善最明显。与空白组比较,模型组小鼠体质量增长受到严重影响,经药物干预后,小鼠体质量增长速度回升,随给药时间延长,中药高剂量组小鼠体质量高于西药组及中药低剂量组。提示益气活血托毒方通过长疗程的治疗可改善机体内环境,发挥整体调节作用。与空白组相比,模型组小鼠血清炎症因子及免疫因子含量均升高。经药物干预后,西药组和中药低、高剂量组炎症因子及免疫因子含量均有所下降,与课题组前期临床研究[3]一致。表明单独应用益气活血托毒方能降低炎症因子水平。
NF-κB通路在前列腺炎的发病机制及炎症、免疫反应中多有涉及[11-13]。TNF-α、IL-1β是NF-κB通路的重要刺激因子[14],IKKs在NF-κB通路活化的联级反应中起核心作用[15],其中IKK-β是IKKs的重要组成之一[16],p-IKK-β是IKK-β的磷酸化产物,可催化IκBα,使IκBα与NF-κB解体[15],从而使NF-κB进入细胞核内催化炎症因子产生和激活免疫反应[17],p-IKK-β在多种炎症反应中过表达[18-19]。NF-κB p65是NF-κB的亚基之一,p-NF-κB p65是其游离状态,p-NF-κB p65表达升高提示解体的NF-κB增多[20]。本研究发现,经益气活血托毒方干预后,模型小鼠前列腺组织p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表达降低,表明益气活血托毒方改善小鼠EAP 可能与降低p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表达,抑制NF-κB通路,减少磷酸化IKKs合成有关。
敦煌古方大泻肾汤(茯苓、甘草、制大黄、黄芩各10 g,赤芍、干姜各3 g)可降低EAP大鼠前列腺组织NF-κB p65表达[21],前列消汤(滑石20 g,金钱草、板蓝根、丹参、芦根各15 g,黄柏、苍术、虎杖、神曲、厚朴各10 g,苦杏仁、甘草各6 g,细辛3 g)能降低EAP大鼠前列腺组织NF-κB p65和NF-κB p50表达[22]。2项研究NF-κB p65表达降低与本研究结果一致,但其应用药物以清热解毒为主,而益气活血托毒方组成以健脾益气为主,2种中医治法指导下均起到影响NF-κB通路、改善前列腺炎病理作用,其共性部分有待进一步研究。
综上所述,益气活血托毒方可改善EAP小鼠前列腺炎症,其机制与下调p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β表达,减少磷酸化IKKs的合成相关。本研究为阐述益气活血托毒方治疗Ⅲ型前列腺炎提供实验证据,今后将继续探索该方起效的主要成分及相应机制。