高效液相色谱串联质谱法测定通心络胶囊中3种化合物的含量

李霄,黄海,刘慢*

(1.黄河科技学院 河南省小分子新药研发国际联合实验室,河南 郑州 450063;2.河南迈英诺医药科技有限公司,河南 郑州 450007)

随着国家对中医药的重视,中成药也得到了飞速的发展,以其具有性质稳定,疗效确切以及毒副作用小的优点,使其在临床上的应用日益增多[1-2]。例如自2019年12月爆发的新冠肺炎以来,中成药莲花清瘟胶囊在抗肺炎中发挥了独特的作用和优势[3]。中成药由多种中药材加工而成,有效成分较多,药效物质基础不明确,原料药材容易受品种,产地,加工方法等因素的影响,使中成药在质量控制方面有一定地阻碍。该选题主要以通心络胶囊为例,在其目前质量控制检测方法的基础上,用超高效液相色谱串联质谱同时检测多种化学成分作为其质量控制标准。

通心络胶囊收载于《中国药典》2020 年版一部,主要由蝉蜕、水蛭、赤芍、全蝎、土鳖虫、檀香、乳香、冰片、酸枣仁、蜈蚣、降香与人参制成,具有益气活血、疏络止痛的作用,对于治疗冠心病心绞痛疾病有着明显的疗效,且无不良反应,副作用小,是近些年广泛应用于治疗脑血管疾病的中成药制剂[4-8]。通心络胶囊现行质量标准是以高效液相色谱(HPLC)测定赤芍中芍药苷的含量(每粒不得少于0.30 mg)作为质量控制标准,该检测方法灵敏度低,分离度低,色谱干扰性比较大,且检测时间较长[9-12]。目前超高效液相色谱串联质(UPLC-MS/MS)对复杂多组分的样品测定具有很大的技术优势,已经成为中药质量控制的重要发展方向[13-17]。因此,该实验主要使用UPLC-MS/MS仪器,建立同时测通心络胶囊中3种成分(芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷Rg1)的含量的实验方法,作为该药物的质量控制标准。该分析检测方法样品处理简单,专一性比较强,灵敏度高,分析检测时间短,在通心络胶囊的质量控制方面具有一定的应用价值。芍药苷、斯皮诺素和人参皂苷Rg1的结构式分别如下图1所示。

图1 芍药苷(a)、斯皮诺素(b) 和 人参皂苷 Rg1(c)的化学结构式

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

Agilent1290/6420 超高液相色谱-串联质谱联用仪,色谱柱(Agilent Poroshell Plus C182.1 mm×50 mm,1.9 μm),移液枪(美国瑞宁),十万分之一电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器);KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 实验试剂

超纯水(湖南科尔顿水务有限公司);乙腈(质谱纯,赛默飞世尔科技有限公司);甲醇(质谱纯,赛默飞世尔科技有限公司);甲酸(上海瀚思化工有限公司);标准品:人参皂苷Rg1 (批号:B21055)和芍药苷(批号:B21148)和斯皮诺素(批号:B21200)均购于上海源叶生物科技有限公司,所购得标准品的纯度>98%。不同批次的通心络胶囊样品购于郑州各药店,样品批号分别为:A2003009,A2005045,B2012020。

1.3 实验方法

1.3.1 分析条件

色谱条件:Agilent Eclipes Plus C18(2.1 mm×50 mm,1.9 μm)色谱柱,流动相A:0.05%(体积分数)的甲酸水溶液,B:0.05%(体积分数)的甲酸-乙腈,流速:0.3 mL/min,进样量:10 μL,柱温箱:40 ℃,梯度洗脱程序:0～0.2 min,(90%A～10%B),0.2～5 min,(60%A～40%B),5～6 min,(0%A～100%B),6～8 min,(90%A～10%B)。

质谱条件:多反应监测模式(MRM),正/负离子扫描,(ESI)电喷雾离子源,脱溶剂气体是N2,流速为12 L/ min,离子化温度为345 ℃,毛细管电压为4.0 kV,碰撞气氮气。三个分析物的质谱检测见表1,提取的分析物的总离子流图见图2。

表1 3个分析物的UPLC-MS/MS检测参数

图2 标准品(a), 芍药苷(b) ,斯皮诺素(c)和人参皂苷Rg1 (d)的多反应监测(MRM)色谱图

1.4 溶液的配制

1.4.1 对照品溶液的配制

分别准确称取芍药苷、斯皮诺素和人参皂苷Rg1标准品5.0 mg于10 mL的容量瓶中,并使用50%(体积分数)甲醇溶解后定容,摇匀,即可得0.5 mg/mL的标准溶液。再分别使用移液枪移取600 μL的芍药苷、40 μL斯皮诺素和40 μL的人参皂苷Rg1到10 mL的容量瓶中,用50%的甲醇定容后分别制成含芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷Rg1 标准品30.0 μg /mL,2.0 μg /mL,2.0 μg /mL的混合对照品溶液待用。

1.4.2 供试品溶液的配制

精密称量通心络胶囊粉末100.00 mg到10 mL容量瓶中,用50%的甲醇溶解并定容,随后超声10 min使其溶解均匀。取其超声后溶液用0.45 μm的微孔滤膜进行过滤,所得滤液即为供试品溶液。

2 实验结果

2.1 实验结果

2.1.1 线性关系考察以及检出限和定量限

吸取0.5 mL混合对照品溶液,在“1.4.1”基础上,再稀释一倍,配成芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷Rg1的质量浓度分别为10,1,1 μg/mL的混合对照品。并对其进行逐级稀释,使形成浓度梯度。按照“1.3.1”的分析方法测试,记录各浓度下芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷Rg1的色谱峰面积,以化合物的浓度为横坐标,定量离子的峰面积为纵坐标,得每个化合物的线性回归方程和线性关系。芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷Rg1的回归方程、相关系数及线性范围分别为:y=22 595x+57 989,r=0.998 1,10.0～10 000.0 ng/mL;y=56 364x+1 429.6,r=0.999 6,1.0～

1 000.0 ng/mL;y=3 591x+64.388,r=0.998 0,10.0～1 000.0 ng/mL。在10 ng/mL的混合对照品的基础上,50%的甲醇水稀释,按照“1.3.1”的分析方法测试,当信噪比S/N是3和10时得该方法的检测限和定量限。其检测限分别为:2.0,0.4,3.4 μg /mL;定量限分别为:6.8,1.4,11.5 μg /mL。

2.1.2 精密度试验

取“1.4.1”项下制备的混合对照品溶液,按“1.3.1”项下所记录分析条件连续进样6次,并进行测定,结果显示:芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷Rg1峰面积的RSD值分别是0.45%,0.64%,2.01%,表明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性试验

精密称取通心络胶囊样品6份,按“1.4.2”项下所记录方法处理,平行制备6份供试品溶液,按“1.3.1”项下分析方法进样,结果显示芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷Rg1峰面积的RSD值分别为1.8%,2.3%,2.2%,表明该方法重复性良好。

2.1.4 稳定性试验

按照“1.4.2”项下条件配置供试品溶液,按“1.3.1”项下所记录分析条件,分别在0,2,4,6,8,24 h进行测定,结果表明芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷 Rg1峰面积的RSD值分别为:2.5%,4.2%,3.6%。说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.5 加标回收率试验

取同一批次样品(批号:A2003009),按“1.4.2”项下记所录方法处理,平行制备6份供试品溶液,按“1.3.1”项下所记录分析条件,测出其芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷Rg1的峰面积,并依据“1.4.3”项下的线性回归方程,计算出每组样品中芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷 Rg1的浓度。再将这6份供试品溶液每份各取200 μL于样品小瓶中,并各加“1.4.1”项方法下配制的混合对照品溶液200 μL,得到通心络胶囊的样品加标溶液。按“1.3.1”项下所记录的分析条件进行处理,记录峰面积并计算其加标回收率。计算结果见表2。

表2 芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷 Rg1 的加样回收率结果(n=6)

2.2 样品含量测定

本次测量选取同一厂家3个不同批次的样品,每个批次按“1.4.2”项下所记录的方法制配6份样品,按“1.3.1”项下所记录分析条件进行分析,记录峰面积并计算样品中芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷Rg1的含量的平均值。结果见表3。

表3 通心络胶囊中芍药苷、斯皮诺素、人参皂苷Rg1含量(n=3) 单位:μg/g

3 讨论

3.1 检测方法选择

本实验初期使用HPLC法检测,由于人参皂苷Rg1含量低,紫外吸收弱,斯皮诺素与芍药苷的极性相近,分离度和灵敏度均比较低,且样品背景干扰比较大,实验结果的准确性相对较差,故选择专一性相对较强,灵敏度相对较高的LC-MS/MS的MRM(多反应监测)模式进行定量检测。

3.2 色谱条件选择

并对该检测方法的色谱条件的优化:考察了不同体系的流动相和不同的色谱柱对样品分离效果的影响。分别采用中性乙腈和水体系、乙腈(0.02% 甲酸,体积分数)和水乙腈(0.02%甲酸,体积分数)体系,实验发现在酸性体系下,化合物的峰型对比较对称以及质谱信号较强。由于芍药苷与斯皮诺素的极性相近,故实验过程中我们试验了三根色谱柱,化合分别是:Agilent Poroshell 120 Ec-C18(3.0 mm×50 mm,2.7 μm)、Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)、Agilent Poroshell 120 Ec-C18(2.1 mm×50 mm,1.9 μm)。结果表明:在使用Agilent Poroshell 120 Ec-C18(2.1 mm×50 mm,1.9 μm)柱时芍药苷与斯皮诺素的分离度最比较大。同时该方法采用梯度洗脱,可以有效提高洗脱能力,节省溶剂,缩短分析时间。

3.3 质谱条件优化

质谱条件进行优化,人参皂苷Rg1、芍药苷都在负离子模式下质谱信号强,而斯皮诺素在正离子模式下质谱信号强。通过离子扫描找寻三个化合物相对应的碎片离子,并优化了MRM检测模式下每个化合物的裂解电压和碰撞能量,以保证被检测的化合物都有较高的质谱响应信号。

3.4 样品处理条件的优化

在处理样品时,我们分别从溶剂的种类,比例、超声的时长上进行优化。首先分别使用75%乙醇,50%、75%的甲醇水溶液和纯甲醇溶解样品(不同比例的溶剂都做三组平行实验),检测结果表明,使用50%甲醇水溶液作溶剂时相较于其他比例的溶剂3个化合物有最大峰面积。再以50%的甲醇水溶液处理样品,分别设置超声时间为10,20,30,40 min。结果表明:超声10 min后3个化合物的峰面积已经达到最大值。

4 结论

使用UPLC-MS/MS建立了快速检测通心络胶囊中芍药苷、斯皮诺素和人参皂苷Rg1含量的方法,并对该方法进行了方法学验证,该方法具有前处理简单、灵敏度高、检测时间短、专一性强等优点,为通心络胶囊的质量标准以及质量控制的完善提供了可靠依据。