激活α2A 肾上腺素受体抑制背根神经节卫星胶质细胞活性缓解镜像痛敏*

杨 盼 闫成祥 朱利香 姜 鸣 杨 亮 侯仁浩 王江博曹园园 刘 霞△ 白占涛△

（1 延安大学生命科学学院多肽药物研究中心，陕西省区域生物资源保护与利用工程技术研究中心，延安 716000；2 延安多肽药物工程技术研究中心，延安 716000；3 延安神经免疫肿瘤与干细胞重点实验室，延安 716000）

当个体受到伤害性刺激时会作用于外周感受器引起外周组织释放炎症因子，通过细胞内信号转导的级联机制激活伤害性感受器，促使高阈值感受器转变为低阈值感受器，造成痛觉过敏[1]。导致脊髓损伤、炎性疼痛及神经病理性疼痛等慢性疼痛的发生，已报道疼痛病人有11.9%患有无法控制的神经病理性疼痛[2]。其中5%复杂性区域疼痛综合征的病人检测到双侧躯体对称部位的异常性疼痛，在动物疼痛模型也同样，这种躯体某一部位损伤后，在损伤部位周围区域及身体对侧相应部位出现持续性的自发痛或痛敏现象称之为镜像痛敏 (mirror-image pain, MIP)[3～6]。在临床研究中，慢性疼痛病人MIP症状频发，但MIP 在引起对侧肢体疼痛之后，其症状相对缓和，临床也会忽视对MIP 的预防和治疗[6]。MIP 在慢性疼痛病人中反复出现，对病人生活及健康造成极大的影响，因此，探究MIP 发生机制已成为治疗疼痛发生的重要研究方向。

MIP 的发生在中枢和外周受多种神经活性物质共同调节。鞘内注射α1 肾上腺素受体拮抗剂酚妥拉明(phentolamine)增加了对侧星形胶质细胞中谷氨酸转运体-1 (glutamate transporters-1, GLT-1)蛋白水平，改善了对侧后肢50%缩足阈值，表明鞘内注射α1 肾上腺素拮抗剂上调脊髓GLT-1 缓解MIP[7]。星形胶质细胞是分布最广泛的神经胶质细胞，其增殖和活化与疼痛发生和维持密切相关[8,9]，星形胶质细胞通过间隙连接彼此形成相互连接网络。Yang等[10]发现G-蛋白偶联受体超家族成员多巴胺D2 受体调节星形胶质细胞间隙连接蛋白Cx43 通道开放和磷酸化而介导MIP 的发生。α2A 肾上腺素受体（α(2A)AR）作为G-蛋白偶联受体超家族成员之一，在外周和中枢系统均有分布[11]。α(2A)AR 激动剂可乐定(clonidine, Clo)作为镇痛药物，在临床中有降低心率的功能[12,13]。对大鼠进行部分坐骨神经结扎后，引起双侧行为痛觉过敏，双侧神经胶质激活标记物和细胞因子[14]。腹腔内注射Clo 显著抑制双侧机械痛和热痛，抑制胶质细胞活化和促炎细胞因子TNF-α和IL-6 表达。背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)中的胶质细胞对神经损伤作出反应，产生炎症标志物，促进慢性疼痛的发展[2]。α(2A)AR 和神经胶质细胞均可通过不同途径参与MIP 的发生，但在DRG 中两者介导MIP 产生的潜在机制尚待阐明。本研究基于蝎蛰致痛MIP 模型，进一步探究α(2A)AR、神经胶质细胞在DRG 中参与MIP 的调控机制，以期找出MIP 发生的DRG 新路径。

方 法

1.实验动物

体重为200～250 g 的成年雄性SD (sprague-dawley, SD)大鼠购于中国科学院上海斯莱克实验动物有限责任公司（SCXK (沪) 2022-0004），常规动物房饲养，每笼5 只，自由饮食，室温21～26℃，空气湿度50%，12 h 昼夜交替。所有实验过程遵循国家实验动物使用指南和国际疼痛学会(International Association for the study of pain, IASP)清醒动物疼痛实验守则，经延安大学动物伦理委员会审核通过（伦理批号yadx-smll-2021-0651）。

2.仪器设备

vonFrey 纤维(58011, Stoelting Co, USA)，辐射热刺激器 （PL-200，成都泰盟科技有限公司），Leica 切片机（CM1900，北京悦昌行科技有限公司），激光共聚焦显微镜（Zeiss 800，卡尔蔡司(上海)管理有限公司）。

3.药品准备及实验动物分组

BmK I：河南郑州东亚钳蝎养殖场购买的东亚钳蝎粗毒，经分离纯化得到单一组分BmK I[15,16]。将10 μg BmK I 溶于50 μl 9%氯化钠注射液(Saline)，经大鼠左后足底中心皮下注射。以足底注射50 μl 无菌0.9%氯化钠注射液为实验对照。可乐定(4205-90-7, Sigma)：0.9%氯化钠注射液溶解，浓度分别为0.2 μg/μl、1 μg/μl 和5 μg/μl。参照Mestre 等[17]的方法实施鞘内给药。

32 只SD 大鼠随机分为4 组(n= 8)，鞘内分别注射10 μl 的0.9%氯化钠注射液、2 μg Clo、10 μg Clo 和50 μg Clo，30 min 后，足底皮下注射10 μg/50 μl 的BmK I，以足底和鞘内均注射0.9%氯化钠注射液为对照。BmK I 注射完成后立即进行自发痛检测，并于4 h 和8 h 检测机械痛和热痛阈值。

4.行为学测试

（1）自发痛：提前将大鼠放于行为学室适应环境，在测试箱适应30 min。测试箱为20 cm×20 cm×30 cm 的带有透明玻璃底板的透明有机玻璃箱，放置在桌子上方75 cm 的支架上。鞘内注射Clo 30 min后，根据实验需求给大鼠足底分别注射0.9%氯化钠注射液和不同浓度的BmK I，立即放回测试箱，连续观察记录自发疼痛行为2 h，记录内容包括每5 min 内大鼠同侧和对侧足的缩足次数、舔足时间及次数、静止时间，保持每5 min 记录1 次。

（2）机械痛：自发痛检测完成后，将大鼠按照编号放回鼠笼安静30 min 后再适应30 min 至1 h，每只大鼠单独放置。待大鼠安静后用vonFrey 纤维(0.008～300 g)测定机械刺激缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold, MWT) 。

（3）热痛：大鼠放置于20 cm×20 cm×30 cm大小的透明有机玻璃箱内（2 mm 厚玻璃底板），测量其对热刺激的敏感性。辐射热刺激直接施加在大鼠左足足心处。自动切断时间为25 s，在同一位点重复测量5 次，每2 次测量间隔至少10 min，为消除刺激方式的潜在干扰，不使用第1 次热刺激数据，从随后的4 个热刺激中选取数据取平均值作为热痛阈值。根据这一程序，在实验前1 天确定热缩足反射潜伏期 (thermal withdrawal latency, TWL) 基线。

5.实时定量PCR

大鼠经鞘内注射药物和左足底皮下注射BmK I后，在2 h、4 h、8 h 和24 h 时分别急性分离DRG(L4～L5) 组织，鞘内注射无菌0.9%氯化钠注射液为对照组，进行总RNA 抽提。利用EasyScript One-Step Gdna Removal and cDNA Synthesis SuperMix(AT311-02, TransGen Biotech) 步骤进行cDNA 合成，利 用Trans-Start®Green qPCR SuperMix (AQ101-01,TransGen Biotech) 进行mRNA 表达量检测。实验结束后，利用2-△△Ct法进行相对定量分析。

6.免疫印迹检测 (Western blot)

行为测试后，使用RIPA 裂解液 (P0013B, Beyotine Biotechnology) 提取0.9%氯化钠注射液或给药组(n= 5)大鼠DRG 总蛋白，利用BCA 蛋白浓度测定试剂盒 (PC0020, Solarbio) 定量。利用10%凝胶通过SDS-PAGE 分离所得的蛋白质，并转至PVDF 膜 (IPVH00010, Millipore) 上。使 用ECL 蛋白质印迹试剂(P0018FM, Beyotime Biotechnology)进行可视化。显影仪(5200Multi, Tanon)检测蛋白质条带进行成像，使用Image J 软件进行数据统计与分析。

7.免疫组织化学

行为学测试结束后，大鼠经戊巴比妥钠 (Tc-P8411, Merck) (60 mg/kg)深度麻醉后，灌注0.9%氯化钠注射液。分离DRG，在4℃条件下4%多聚甲醛(143174, Biosharp)中固定48 h。然后将DRG浸润在20%蔗糖（10021418，沪试）中24 h，用30%蔗糖浸润至少48 h。使用Leica (CM1900)切片机制备切片(20 μm)。使用PBST [PBS (AP0321,AccuRef Scientific) + 0.3%Triton X-100 (T8200, Solarbio)]漂洗3 次，每次10 min。将切片放置在含有5%血清的PBST 中封闭2 h，孵育一抗GFAP 抗体(1:500, 53-9892-82, Invitrogen)、Integrin αM/CD11b 抗体 (OX42)(1:400, sc-53086, Santa Cruz)、IB4 (1:500, sc-65254,Santa Cruz)、NF200 抗体 (1:500, K009971M, Solarbio)，摇床上 4℃过夜。PBST 洗涤3 次，每次10 min，将荧光二抗滴加在组织切片上，室温下避光孵育2 h，弃掉二抗溶液。添加DAPI 溶液(1:1000, C0060,Solarbio)，PBST 洗涤 3 次，每次10 min。滴加荧光封片剂(P0128S, Beyotime Biotechnology)后封片并干燥。使用具有20×物镜的共聚焦显微镜(Zeiss 800)获取一系列荧光图像。使用Image J 软件进行图像统计分析。

8.统计学分析

本研究数据使用Image J 和GraphPad Prism 8.0软件进行统计和分析。使用t检验、One-way ANOVA和Two-way ANOVA 进行组间差异性分析，统计结果采用均数±标准误(±SEM) 表示。P＜ 0.05 认为差异有统计学意义。

结 果

1.α(2A)AR 在DRG 中广泛分布

首先，采用免疫组织化学分析正常SD 大鼠DRG 中α(2A)AR 的分布情况。结果表明，α(2A)AR与OX42（小胶质细胞标记物）、IB4（非肽能神经元标记物）、GFAP（卫星/星形胶质细胞标记物）和NF200（大直径神经元标记物）均有共定位（见图1A-D)，其中α(2A)AR 与小胶质细胞的共定位为60%（见图1A），与非肽能神经元的共定位为37%（见图1B），与卫星/星形胶质细胞的共定位为75%（见图1C），与大直径神经元的共定位为50%（见图1D）。上述结果表明，α(2A)AR 在DRG 中大量分布，特别是在胶质细胞中广泛分布。

图1 α(2A)AR 在DRG 中广泛分布(A) α(2A)AR（红色）和OX42（绿色）免疫荧光图像及共定位分析；(B) α(2A)AR（红色）和IB4（绿色）免疫荧光图像及共定位分析；(C) α(2A)AR（红色）和GFAP（绿色）免疫荧光图像及共定位分析；(D) α(2A)AR（红色）和NF200（绿色）免疫荧光图像及共定位分析。比例尺 = 50 μmFig.1 α(2A)AR widely distribute in DRG(A) α(2A)AR (red) and OX42 (green) immunofluorescence images and colocalization analysis; (B) α(2A)AR (red) and IB4 (green) immunofluorescence images and colocalization analysis; (C) α(2A)AR (red) and GFAP (green) immunofluorescence images and colocalization analysis; (D) α(2A)AR (red) and NF200 (green) immunofluorescence images and colocalization analysis.Scale bar = 50 μm

2.MIP 过程中双侧DRG 中α(2A)AR 不对称表达

为明确DRG α(2A)AR 是否参与MIP 过程，利用实验室构建的东亚钳蝎蝎毒素BmK I MIP 模型[10]，检测MIP 不同时间点，双侧DRG 中α(2A)AR 的表达。结果显示，BmK I 注射2 h 时，同侧DRG 中α(2A)AR mRNA 表达升高，在 1 h、4 h、8 h 和24 h与对照组相比无差异（见图2A）。在对侧DRG 中，BmK I 注射后1 h、2 h、4 h、8 h 和24 h 与对照组相比均无显著差异（见图2B）。使用蛋白质免疫印迹法检测BmK I 刺激后2 h、4 h、8 h 和24 h，双侧DRG 中α(2A)AR 蛋白的表达变化。结果表明，与对照组相比，同侧DRG 中α(2A)AR 蛋白表达水平在2 h、4 h、8 h 和24 h 均显著升高，在4 h 表达量最高（见图2C），而在对侧DRG 中，2 h、4 h、8 h 和24 h 均升高，在2 h 达到最大值（见图2D）。这些数据表明，疼痛状态下，α(2A)AR 在双侧DRG 中的表达存在不对称性，提示α(2A)AR 参与MIP 的发生发展。

3.激活α(2A)AR 缓解镜像疼痛行为

为了进一步评估DRG α(2A)AR 是否参与镜像疼痛行为，在BmK I 注射前30 min，鞘内注射Clo或等量的0.9%氯化钠注射液作为对照组，检测其对BmK I 诱导的疼痛行为的影响（见图3A）。Clo处理后，大鼠缩足次数减少，缩足次数随着Clo 浓度的增加略有减少（见图3B）。2 μg Clo 缩足次数比对照组低30%，10 μg Clo 退缩总数比对照组低50%，50 μg Clo 缩足次数比对照组低70%（见图3C）。此外，与基线相比，BmK I 刺激后4 h 和8 h的双侧机械痛反应阈值降低（见图3D）。此外，Clo 组则增加4 h 和8 h 同侧和对侧的机械痛阈值（见图3E, 3F），但热敏反应阈值无明显差异（见图3G, 3H）。这些结果表明，激活α(2A)AR 显著缓解了BmK I 诱导的MIP 行为。

图3 激活 α(2A)AR 抑制镜像疼痛行为(A)药物注射和行为测量时间表的示意图；(B)鞘内注射2 μg、10 μg 和50 μg Clo 后每5 min 自发缩足次数(n = 8)；(C) Clo 治疗后2 h 内的退缩总数(n = 8)；(D) Clo 治疗后2 h 舔咬抬足行为时间(n = 8)；Clo 治疗后同侧(E)和对侧(F)机械痛敏阈值分析(n = 8)；Clo 治疗后同侧(G)和对侧(H)热痛敏阈值分析(n = 8)**P ＜ 0.01，****P ＜ 0.0001，与Control 组相比Fig.3 Activation of α(2A)AR alleviates mirror-image pain behaviors(A) Schematic of drug injection and behavioral measurement schedule; (B) Number of spontaneous paw withdrawal per 5 min after intrathecal injection of 2 μg, 10 μg, and 50 μg Clo (n = 8); (C) Total number of flinches within 2 h after Clonidine treatment (n = 8); (D) Time of licking, biting and foot lifting behavior 2 h after Clo treatment (n = 8); Analysis of ipsilateral (E) and contralateral (F) mechanical hyperalgesia threshold after Clo treatment (n = 8); Analysis of ipsilateral (G)and contralateral (H) thermal hyperalgesia thresholds after Clo treatment (n = 8).**P ＜ 0.01, ****P ＜ 0.0001, compared with group Control.

4.激活α(2A)AR 促进双侧DRG 胶质细胞活化

为了进一步探究MIP 发生发展中双侧DRG 胶质细胞表达情况，首先利用免疫印迹检测MIP 发生发展中DRG 双侧GFAP 和OX42 的蛋白表达（见图4A, 4B）。结果显示，在BmK I 刺激下，同侧DRG中卫星胶质细胞标志物GFAP在2 h上调，在4 h、8 h 和24 h 与对照组相比无差异（见图4C）。对侧DRG 中卫星胶质细胞标志物蛋白GFAP 在24 h 表达上调，在2 h、4 h 和8 h 表达与对照组相比无差异（见图4D）。此外，在BmK I 刺激下，与对照组相比，同侧DRG 中OX42 在2 h 至24 h 蛋白表达下调（见图4E），而对侧DRG 中OX42 在2 h 至4 h 蛋白表达上调，在2 h 达到峰值，但在24 h 时下调（见图4F）。以上结果表明，MIP 发生发展中双侧DRG中胶质细胞标志物蛋白表达存在差异性。

图4 Bmk I 刺激下DRG 中胶质细胞标志物蛋白表达分析(A) Bmk I 刺激下，DRG 中同侧GFAP、OX42 蛋白表达；(B) Bmk I 刺激下，DRG 中对侧GFAP、OX42 蛋白表达；(C) Bmk I 刺激下，DRG 中同侧GFAP 蛋白表达分析(n = 5)；(D) Bmk I 刺激下，DRG 中对侧GFAP 蛋白表达分析(n = 5)；(E) Bmk I 刺激下，DRG 中同侧OX42 蛋白表达分析(n = 5)；(F) Bmk I 刺激下，DRG 中对侧OX42蛋白表达分析(n = 5)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.0001，与Control 组相比Fig.4 Expression of glial proteins in DRG under Bmk I stimulation(A) The expression of ipsilateral GFAP and OX42 proteins in DRG stimulated by Bmk I; (B) The expression of contralateral GFAP and OX42 proteins in DRG stimulated by Bmk I; (C) Analysis of ipsilateral GFAP protein expression in DRG under BmkI stimulation (n = 5); (D) Analysis of contralateral GFAP protein expression in DRG under Bmk I stimulation(n = 5); (E) Analysis of ipsilateral OX42 protein expression in DRG under Bmk I stimulation (n = 5); (F) Analysis of ipsilateral OX42 protein expression in DRG stimulated by Bmk I (n = 5).*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001, ****P ＜ 0.0001, compared with group Control.

为明确MIP 发生发展中双侧DRG 中α(2A)AR对胶质细胞的影响，在BmK I 注射前30 min 鞘内注射Clo。结果显示，鞘内注射Clo 后，同侧DRG中α(2A)AR mRNA 水平在1 h 时降低，2 h、4 h 和8 h 逐渐恢复至对照组水平，但在24 h 表达下调（见图5A），对侧DRG 中，α(2A)AR 在1 h 至24 h 明显降低（见图5B）；同侧DRG 中α(2A)AR 蛋白水平在2 h 无差异，在4 h、8 h 和24 h 蛋白表达上调（见图5C, 5E），对侧DRG 中α(2A)AR 蛋白在2 h、4 h、8 h 和24 h 显著升高（见图5D, 5H）；同侧GFAP 蛋白水平在2 h 无差异，在4 h、8 h 和24 h 极显著升高（见图5F），对侧GFAP 蛋白水平在2 h至24 h 明显下调（见图5I）；同侧DRG 中OX42 蛋白在2 h 至24 h 明显上调，24 h 最高（见图5G），对侧OX42 蛋白在2 h 至24 h 明显上调，24 h 达到最大值（见图5J）。以上数据表明，激活 DRG 中α(2A)AR 会改变双侧胶质细胞标志物的蛋白表达，与已有研究一致[18]。MIP 发生发展过程中，α(2A)AR激活引起同侧DRG 中卫星胶质细胞和双侧小胶细胞标志物表达上调，但是激活α(2A)AR 抑制了对侧DRG 卫星胶质细胞标志物的表达。说明DRG 中卫星胶质细胞参与了α(2A)AR 介导的MIP 镇痛效应。

图5 激活α(2A)AR 抑制对侧DRG 卫星胶质细胞的激活可乐定治疗后1 h、2 h、4 h、8 h 和24 h 同侧α(2A)AR (A)和对侧α(2A)AR (B) mRNA 表达量；可乐定治疗后 2 h、4 h、8 h 和24 h 时α(2A)AR、GFAP 和OX42 同侧(C)和对侧(D) 蛋白表达图；可乐定治疗后 2 h、4 h、8 h 和24 h同侧α(2A)AR (E)和对侧α(2A)AR (H)蛋白分析(n = 5)；可乐定治疗后 2 h、4 h、8 h 和24 h 同侧GFAP (F) 和对侧GFAP (I)蛋白分析(n = 5)；可乐定治疗后2 h、4 h、8 h 和24 h 同侧OX42 (G) 和对侧OX42 (J)蛋白分析(n = 5)*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，****P ＜ 0.0001，与Control 组相比Fig.5 Activation of α (2A) AR inhibits contralateral DRG satellite glia Ipsilateral (A) and contralateral (B) mRNA expression of α(2A)AR after clo treatment at 1 h, 2 h, 4 h, 8 h and 24 h.The α(2A) AR, GFAP, and OX42 ipsilateral (C) and contralateral (D) protein expression at 2 h, 4 h, 8 h, and 24 h after treatment with clonidine.The ipsilateral α(2A)AR (E) and contralateral α(2A)AR (H) protein expression analysis after clonidine treatment at 2 h, 4 h, 8 h and 24 h (n = 5).The ipsilateral GFAP (F) and contralateral GFAP (I) protein expression analysis after clonidine treatment at 2 h, 4 h, 8 h and 24 h (n = 5).The ipsilateral OX42 (G) and contralateral OX42 (J)protein expression analysis after clonidine treatment at 2 h, 4 h, 8 h and 24 h (n = 5).*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ****P ＜ 0.0001, compared with group Control.

5.激活α(2A)AR 降低DRG 卫星胶质细胞中α(2A)AR 的表达

MIP 期间DRG 胶质细胞中α(2A)AR 的表达情况结果显示，BmK I 刺激下，同侧（见图6A）及对侧（见图6B）DRG 在4 h 时α(2A)AR 与GFAP 共定位均明显升高，给药Clo 后，α(2A)AR 与GFAP 的共定位均明显降低。在BmK I 刺激下，同侧DRG在4 h 时α(2A)AR 与OX42 共定位升高，给药Clo后，α(2A)AR 与OX42 共定位无明显变化（见图6C），对侧DRG 中 α(2A)AR 与OX42 共定位无明显差异，给药Clo后α(2A)AR与OX42无明显差异（见图6D）。表明激活α(2A)AR 降低DRG 卫星胶质细胞中α(2A)AR 的表达，而不影响小胶质细胞中α(2A)AR的表达。提示DRG 卫星胶质细胞中的α(2A)AR 调控MIP 发生发展。

图6 激活α(2A)AR 降低DRG 卫星胶质细胞中α(2A)AR 的表达(A) BmK I 刺激后4 h，DRG 中同侧α(2A)AR（红色），可乐定处理后 4 h，α(2A)AR（红色）与GFAP（绿色）双荧光代表性图像及分析；(B) BmK I刺激后4 h，DRG中对侧α(2A)AR（红色），可乐定处理后 4 h ，α(2A)AR（红色）与GFAP（绿色）双荧光代表性图像及分析；(C) BmK I 刺激后4 h，DRG 中同侧α(2A)AR（红色），可乐定处理后4 h，α(2A)AR（红色）与OX42 （绿色）双荧光代表性图像及分析；(D) BmK I 刺激后4 h，DRG 中对侧α(2A)AR （红色），可乐定处理后4 h，α(2A)AR（红色）与OX42 （绿色）双荧光代表性图像及分析。比例尺 = 100 μm*P ＜ 0.05，****P ＜ 0.0001，与Control 组相比Fig.6 Activation of α(2A)AR reduces the expression of α(2A)AR in DRG satellite glia cells(A) Dual-fluorescence representative images and analysis of ipsilateral α(2A)AR (red) in DRG after 4 h of BmK I stimulation, α(2A)AR (red) and GFAP (green) after 4 h of clonidine treatment; (B) Dual-fluorescence representative images and analysis of contralateral α(2A)AR (red) in DRG 4 h after BmK I stimulation, α(2A)AR (red) and GFAP (green) 4 h after clonidine treatment; (C) Dual-fluorescence representative images and analysis of ipsilateral α(2A)AR (red) in DRG at 4 h after BmK I stimulation and α(2A)AR (red) and OX42 (green) at 4 h after clonidine treatment; (D) Dual-fluorescence representative images and analysis of contralateral α(2A)AR (red) in DRG 4 h after BmK I stimulation and α(2A)AR (red)and OX42 (green) 4 h after clonidine treatment.Scale bar = 100 μm*P ＜ 0.05, ****P ＜ 0.0001, compared with group Control.

讨 论

MIP 的发生过程伴随着复杂的生理和生化变化。本研究显示，鞘内注射Clo 大鼠缩足次数减少，机械痛阈值增加，说明Clo 起到镇痛作用。已有研究表明，大鼠腹腔内注射 α(2A)AR 激动剂 Clo 显著抑制双侧机械痛和热痛的发生[14]。与Clo 在临床中起着镇静、降低心率等作用[12]相一致，与2 μg 和5 μg Clo 剂量相比，50 μg Clo 剂量下镇痛效果最佳，更能缓解MIP 的发生。在DRG 中α(2A)AR 在胶质细胞和神经元细胞均有大量表达，α(2A)AR 在DRG卫星胶质细胞中高表达，这可能与DRG 中的胶质细胞参与慢性疼痛的发展[2]有关。已有研究表明，卫星胶质细胞缝隙连接通道与 G-蛋白偶联受体超家族成员互作介导疼痛的发生[2]。α(2A)AR 作为 G-蛋白偶联受体超家族成员，参与疼痛的发生过程[11]。

疼痛状态下，α(2A)AR 在双侧DRG 中的表达存在不对称性，再次表明α(2A)AR 参与MIP 的发生发展。大鼠进行部分坐骨神经结扎后，双侧神经胶质激活标记物增加[14]。本研究的结果显示，双侧胶质细胞的表达在不同MIP 时间点呈现双侧时间差异性，在BmK I 刺激下，与对照组相比同侧DRG 中GFAP 标志物在2 h 表达上调，对侧在24 h 表达上调；同侧OX42 表达下调，对侧表达上调，提示MIP 过程中DRG 胶质细胞表现出双侧异质性，胶质细胞参与了MIP 发生。已有研究表明，卫星胶质细胞缝隙连接介导的细胞网络，允许各种离子和炎症介质的扩散，以促进异常性疼痛信号传导和远距离传输[19]。齐雪涛等[20]报道，动物经历特定行为事件时，大脑中与此行为相关的神经元会激活，c-fos、Arc 等表达上调。脊髓卫星胶质细胞的激活有助于紫杉醇诱导的神经性疼痛的发病机制的形成，给药紫杉醇后7 天（即小鼠出现热痛的时间点），GFAP 转录物水平升高5 倍以上，GFAP 蛋白表达增加，卫星胶质细胞活化，靶向卫星胶质细胞激活是调控神经性疼痛的治疗途径[21]。本研究结果发现，BmK I 刺激下，双侧DRG 中卫星胶质细胞中的α(2A)AR 表达上调，α(2A)AR 激活后，双侧DRG 卫星胶质细胞中α(2A)AR 的表达下调，而影响小胶质细胞中α(2A)AR 的表达，这可能与α(2A)AR 激活后引起GFAP的表达升高有关。此外，疼痛刺激下双侧卫星胶质细胞激活，而小胶质细胞活性被抑制，鞘内注射卫星胶质细胞抑制剂后缓解疼痛[18]。

综上所述，本研究证明DRG 中卫星胶质细胞α(2A)AR 参与了MIP 的镇痛效应，进一步表明激活α(2A)AR 抑制对侧DRG 中卫星胶质激活缓解MIP的发生发展。卫星胶质细胞增殖和活化与疼痛发生紧密相关[8,9]，卫星胶质细胞α(2A)AR 参与MIP 发生发展和调控的下游分子通路有待进一步探究。已报道卫星胶质细胞表面表达多种信号传递分子，其中缝隙连接蛋白Cx43 可以传递炎症刺激信号，主要在卫星胶质细胞中表达，是卫星胶质细胞整合核心[22,23]。因此，深入解析DRG 中Cx43 是否参与以及如何参与α(2A)AR 介导的MIP 的发生发展，将可能阐明α(2A)AR 介导MIP 的镇痛机制，为靶向α(2A)AR 治疗或开发MIP 药物奠定理论基础。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。