基于PINK1/parkin信号转导通路研究灵芝孢子对糖尿病心肌损伤的保护作用

吴岚 齐亚灵 程明勋 王勤书 石瑞平 王淑秋 Shaobo ZHOU 葛子正

(1佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007;2佳木斯大学基础医学院微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室;3海南医学院组织学与胚胎学教研室;佳木斯大学 4附属第一医院;5附属第三医院;6 Faculty of Engineering and Science,University of Greenwich;7滁州城市职业学院)

预计到2045年,患糖尿病(DM)人数将到达7亿高峰〔1〕。DM涉及肾脏、心脏、眼睛、神经等多部位的慢性并发症,其中以心血管系统损伤最为常见。Rubler等〔2〕首次提出糖尿病心肌病(DCM)的概念:一种独立于高血压、瓣膜病和冠心病等传统心脏危险因素的特异性心肌病,其典型特征为病理性心肌肥厚、间质纤维化及功能障碍等,最终导致危及生命的心力衰竭。 机体持续暴露于高血糖水平会引起氧化和抗氧化机制失衡,堆积的超氧化物攻击心肌细胞中的线粒体,严重损害心脏代谢。而线粒体自噬是一种靶向线粒体的分解代谢过程,及时将心肌细胞内受损线粒体运输至溶酶体消化分解,有利于心肌细胞在DM应激反应下的生存。PTEN诱导假定激酶(PINK)1/parkin通路是当前研究最多的线粒体自噬信号途径,因帕金森病得名〔3〕。过量的氧化产物同样能够激活细胞凋亡级联反应。事实上,细胞自噬与细胞凋亡既有区别又有联系,共同维护着心肌细胞内稳态。灵芝是中国传统的名贵药材,因具有降血糖、抗炎、抗氧化等多种特性受到广泛关注〔4〕。灵芝孢子是从灵芝的菌褶中弹射的成熟生殖细胞,储存灵芝的全部遗传物质〔5〕。灵芝孢子作为潜在抗DM药物的可行性研究已取得较大进展,但靶向DCM的相关分子机制尚未彻底阐明。本研究旨在探讨灵芝孢子对DM心肌损伤的保护作用及其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 佳木斯大学动物实验中心选购40只SPF级SD雄性大鼠,6～8周龄,体质量190～220 g,饲养于温度适宜(20±2)℃的清洁级动物实验室。实验动物许可证编号:SYXK(黑)2016-014,伦理委员会审批号:JMSU-210。

1.2主要试剂 灵芝孢子购于佳木斯灵芝种植基地;链脲佐菌素购于美国Sigma;PINK1抗体购于上海碧云天;微管相关蛋白轻链(LC)3抗体购于美国CST;p62、parkin抗体购于英国Abcam;p-parkin抗体购于美国Affinity;B细胞淋巴瘤(Bcl)-2同源结构域蛋白抗体(beclin)1、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2抗体购于武汉博士德;超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)试剂盒购于南京建成生物工程研究所;苏木素-伊红染色(HE)、马松(Masson)染色试剂盒购于北京Solarbio。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色试剂盒购于瑞士Roche。

1.3模型建立与分组 大鼠适应性喂养1 w,自由饮食饮水。随机均分成对照(NC)组、高脂高糖饮食(HFD)组、DM组和灵芝孢子(GLS)组。NC组给予基础饲料,其余3组均给予高脂高糖饮食。持续高脂高糖饮食4 w后,DM组和GLS组禁食12 h,一次性腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素(溶于柠檬酸盐缓冲液,避光现配)复制2型DM大鼠模型,NC组和HFD组腹腔注射等量的柠檬酸盐缓冲液。3 d和7 d后监测DM组和GLS组空腹血糖水平,连续两次高于16.7 mmol/L视为模型制备成功。GLS组每天进行1次灵芝孢子(300 mg/kg)灌胃,此浓度参考Yang等〔6〕使用的最高剂量,其余3组灌胃等量生理盐水。

1.4大鼠体质量、心脏指数、空腹血糖检测 给药12 w末,记录各组末次体质量和空腹血糖。全部大鼠禁食不禁水12 h。次日腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,断颈处死动物,在冰台上快速打开胸腔,小心剥离心脏组织,用预冷0.9%生理盐水冲洗干净残留血液,拭干并计算心脏指数(心脏指数=心脏质量/体质量)。剪去心房、右心室及周围结缔组织等,沿垂直长轴方向均分左心室,靠心底部位固定于新鲜配制的4%多聚甲醛溶液,制备5 μm石蜡切片,靠心尖部位置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.5大鼠心肌组织SOD活性、MDA含量检测 准确称取心肌组织制备匀浆液,3 000 r/min离心10 min,取上清液测得OD值。严格按照试剂盒说明书步骤操作。

1.6大鼠心肌组织形态学观察 石蜡切片常规脱蜡至水,行苏木素(染细胞核)-伊红(染细胞质)染色;Masson染色时胶原纤维呈蓝色,肌纤维呈红色。

1.7Western印迹检测 从-80 ℃冰箱中取出冻存心肌组织,加入适量预冷的放射免疫沉淀法(RIPA)组织裂解液,充分剪碎研磨,超声3次,整个流程在冰上操作。低温高速(4 ℃,12 000 r/min)条件下离心15 min,收集上清液,用二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量。取30 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),并湿转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脱脂奶粉封闭非特异性位点后,等渗缓冲盐溶液(TBST)清洗2次,加入PINK1(1∶1 000)、parkin(1∶2 000)、p-parkin(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)、p62(1∶1 000)、beclin1(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)抗体,4 ℃孵育过夜。次日TBST清洗后,37 ℃温箱中孵育相应种属二抗(1∶10 000)1 h。现配增强型化学发光(ECL)曝光液,在凝胶成像系统上显影。

1.8免疫组织化学检测 在60 ℃烤箱烘烤石蜡切片30 min,常规脱蜡至水。枸橼酸微波修复20 min后自然冷却,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。免疫组化笔围绕组织画圈,滴加3%H2O2避光封闭10 min,PBS洗后滴加封闭液,放置37 ℃温箱30 min,勿洗。直接滴加PINK1(1∶100)、parkin(1∶100)抗体,4 ℃孵育过夜。次日PBS洗涤后,37 ℃温箱中孵育相应种属二抗及链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC) 30 min。现配二氨基联苯胺(DAB)显色液,镜下控制染色时间。苏木素复染及脱水,中性树胶封片。

1.9TUNEL染色观察大鼠心脏组织凋亡 石蜡切片常规脱蜡水化,按照试剂盒说明书进行TUNEL荧光染色,使用抗荧光猝灭封片剂封片。及时阅片,断裂DNA呈现绿色荧光。

1.10统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析和LSD检验。

2 结 果

2.1灵芝孢子对DM组体质量、心脏指数、空腹血糖的影响 与NC组相比,HFD组血糖水平无明显波动(P>0.05),体质量和心脏指数显著增加(P<0.05);DM组血糖和心脏指数明显增加,体质量明显下降(P<0.05)。与DM组相比,GLS组和HFD组血糖和心脏指数显著下降,体质量显著增加(均P<0.05)。见表1。

表1 各组体质量、心脏指数、空腹血糖水平、心肌组织MDA含量及SOD活性比较

2.2灵芝孢子对DM组心肌组织MDA含量、SOD活性的影响 与NC组相比,HFD组和DM组MDA显著上调,SOD显著下降(P<0.05);与DM组相比,GLS组和HFD组MDA显著减少,SOD显著上升(均P<0.05)。见表1。

2.3灵芝孢子对DM组心肌组织形态学的影响 NC组心肌细胞排列紧密,形态规则,血管周围仅有较少胶原纤维分布,含量仅为(1.23±0.19)%;HFD组排列稍显疏松,偶见局部断裂,有少量红细胞浸润,胶原含量增加至(2.40±0.17)%;DM组心肌细胞肿胀,边界模糊,排列紊乱,伴有肌纤维明显断裂,可见大量红细胞浸润,蓝染的胶原纤维呈片状沉积,含量高达(4.93±0.40)%。GLS组心肌细胞形态及排列得以改善,胶原含量显著降低至(1.71±0.11)%,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组心肌组织形态学(×400)

2.4灵芝孢子对DM组心肌组织PINK1/parkin通路蛋白水平的影响 与NC组相比,HFD组和DM组心肌组织PINK1、parkin、p-parkin通路蛋白的表达水平明显增高(P<0.05)。与DM组相比,GLS组和HFD组PINK1、parkin、p-parkin表达水平显著下降(P<0.05)。免疫组织化学法检测PINK1、parkin与Western印迹保持一致,棕黄色为阳性表达区域。见图2、图3、表2。

图2 各组心肌组织中PINK1、parkin蛋白表达(免疫组化,×400)

图3 各组心肌组织中PINK1、parkin、p-parkin蛋白表达

表2 各组心肌组织中通路蛋白、自噬蛋白、凋亡蛋白表达比较

2.5灵芝孢子对DM组心肌组织凋亡相关蛋白水平及TUNEL染色的影响 与NC组相比,HFD组和DM组心肌组织中Bax/Bcl-2表达水平明显增高(P<0.05)。与DM组相比,GLS组和HFD组Bax/Bcl-2表达水平显著下降(均P<0.05)。TUNEL荧光染色进一步观察心肌细胞凋亡情况,结果提示,与NC组细胞凋亡率〔(0.35±0.04)%〕比较,HFD组和DM组凋亡率〔(4.19±0.25)%、(13.67±1.15)%〕明显升高(P<0.05)。与DM组比较,GLS组〔(3.48±0.48)%〕和HFD组显著降低(P<0.05)。见表2、图4、图5。

图4 各组心肌细胞凋亡情况(TUNEL染色,×400)

图5 各组心肌组织中LC3、beclin1、p62、Bax、Bcl-2蛋白表达

2.6灵芝孢子对DM组心肌组织自噬相关蛋白水平的影响 与NC组相比,HFD组和DM组心肌组织LC3、beclin1自噬蛋白的表达水平明显增高,p62蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。与DM组相比,GLS组和HFD组LC3、beclin1表达水平显著下降,p62表达水平显著上升(均P<0.05)。见表2、图5。

3 讨 论

2型DM是一种以持续高血糖为特征的慢性代谢性疾病,累及全身多器官病变,DCM是最致命的并发症之一。多种机制参与DCM的发生发展,涉及氧化应激、能量代谢紊乱、线粒体功能障碍等〔7〕,其中高糖诱导的氧化应激是致病的关键因素。心脏较其他器官更容易受过氧化作用的损伤〔8〕。SOD是生物体中最重要的内源性抗氧化酶之一,能够加速游离自由基的转化和失活,保护心肌细胞免受氧化应激的损害〔9〕。MDA是脂质被氧自由基攻击后发生过氧化反应的氧化终产物,具有细胞毒性,最终诱发细胞损伤甚至死亡〔10〕。本研究提示,GLS组大鼠对超氧自由基的清除能力明显增强,氧化应激水平减轻。

当生物体处于氧化应激状态,自噬能够作为一种防御应答手段被启动〔11〕。自噬是一种选择性清除受损细胞成分的保守“自食”过程,而线粒体自噬作为靶向线粒体的自噬形式,能够将遭受氧化损伤的线粒体运输到溶酶体降解,有助于减轻氧化应激。在DM患者的心脏中,高糖/高脂肪酸氧化水平导致了活性氧(ROS)的蓄积,进而攻击心肌线粒体。堆积的障碍线粒体进一步引发更多的ROS产生,形成线粒体损伤和氧化应激加剧的恶性循环〔12〕。因此,线粒体自噬对于维持健康的线粒体状态至关重要,能够有效延缓DCM的发生发展。鉴于线粒体自噬的积极作用,PINK1/parkin介导的线粒体自噬途径有望成为灵芝孢子保护心肌的潜在靶点。基础水平的自噬作为细胞的自我保护机制,能够在线粒体受到病理刺激时被启动,导致PINK1在受损的线粒体外膜表面稳定性聚集,进而招募并激活E3泛素连接酶parkin。泛素化的损伤线粒体被衔接蛋白p62识别后,再与LC3结合形成自噬小体,最终被溶酶体降解〔13,14〕。当自噬持续增高,细胞由于过量消耗内容物无法再继续生存,自噬不再产生积极作用〔15〕。LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、p62是自噬形成过程中重要的自噬标志蛋白,其中p62与自噬活性呈负相关〔16,17〕。本研究提示,以上自噬因子的异常表达可能是DCM进展的诱发因素,而灵芝孢子对DM心肌的保护作用可能是通过调控PINK1/parkin信号通路抑制心肌细胞自噬的过度激活实现的。氧化应激和凋亡同样关系密切,线粒体的过氧化损伤能够加速线粒体通透性转换孔开放,触发细胞色素C等促凋亡因子的释放〔18〕。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡过程重要的调控分子,包含抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等。研究表明,Bax/Bcl-2的比值是细胞存亡的决定性因素〔19〕。本研究提示,灵芝孢子可能通过激活抗凋亡途径,改善高糖对心脏的有害影响。大量报道发现,Bcl-2家族不仅是细胞凋亡的明星靶点,与细胞自噬也有联系。Bcl-2等抗凋亡分子能通过与自噬基因beclin-1相互作用介导细胞自噬〔20〕,还能阻碍parkin向去极化线粒体的易位,从而抑制线粒体过度自噬〔21〕。PINK1/parkin信号通路可能是细胞自噬与凋亡交互作用的关键靶点,二者的关联有待进一步探讨。本研究发现,HFD组大鼠心肌组织的病变程度与DM组有一定差距,推测高脂高糖食物短时间内无法构建2型DM模型,还需进一步深入研究。