园林废弃物混菌堆腐方法及其产物对泥炭的替代效果研究

王 可,邵烨瑶,张培云,杜妍纯,徐强龙,王燕燕,阮文斌,徐思捷,葛杰克,叶 铎,刘 鹏,邢承华,*

(1.金华职业技术学院 农学院,浙江 金华 321017; 2.浙江师范大学 植物学实验室,浙江 金华 321004)

近年来,随着城市绿化的不断完善,园林废弃物的数量逐步增加。在园林废弃物的处理过程中,存在着处理方法单一、处理成本高等问题[1],尤其是以填埋和焚烧为主的处理方式易对环境造成严重污染[2]。

泥炭属不可再生资源。城市绿化建设的推进,也伴随着泥炭资源的大量消耗。我国作为园艺大国,对固体基质,尤其是泥炭的需求量巨大[3],目前已开始出现泥炭资源枯竭的现象[4]。如能对园林废弃物进行资源化利用,甚至替代泥炭,无论是对于泥炭资源的保护还是园林废弃物的减量和循环利用来说,均具有积极的现实意义。但是,园林废弃物中的木质素结构复杂且不规则,将纤维素分子包埋其中,形成了一种天然屏障[5],使得酶不易与其中的纤维素分子接触,导致园林废弃物中的纤维素难以降解。

白腐真菌(white rot fungus)具有独特的木质素降解机制[6],其中,黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)的木质素过氧化酶活性很强;木霉(Trichoderma)是纤维素分解的模式菌,其中,康氏木霉(Trichodermakoningii)的纤维素分解能力较强。当前,利用微生物来降解园林废弃物、研发新基质替代泥炭已成为研究的热点[7]。焦有宙等[8]研究发现,单一菌种无论活性高低,在加快堆腐进程上的效果均逊于复合菌群的共同作用。高晓梅等[9]证实,康氏木霉与黄孢原毛平革菌混合发酵可有效降解水稻秸秆的纤维素、半纤维素和木质素。基于此,本试验拟采用二者的混合菌种对园林废弃物进行发酵。

在针对园林废弃物转化为植物栽培基质可能性的探索中,韦宜慧等[10]研究表明,有机废弃物按照一定比例堆肥可代替泥炭作为基质,椰糠、谷壳、泥炭土、滤泥+园林废弃物以7∶1∶1∶1的比例混合时最有利于桉树生长;Li等[11]的试验揭示,污泥和园林废弃物堆肥能够提高土壤养分、有机质含量和电导率,具有安全性和有效性。综合以上研究可知,采用适当的方法进行园林废弃物堆肥,其产物与泥炭以适当的比例混合可用作种植基质,并能起到改良土壤的作用;但是添加混合菌种对园林废弃物进行发酵,并将其产物用于植物栽培的研究还鲜见报道。为一体化综合解决泥炭资源缺乏、园林废弃物处置难等问题,探寻园林废弃物资源化的现实途径,本试验拟针对园林废弃物的混菌堆肥发酵最佳体系与配比基质进行探究,并设置不同比例的堆腐产物与泥炭组合开展植物栽培,探明其替代泥炭的可行性,为生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验于浙江师范大学进行。供试园林废弃物系取自金华职业技术学院草丛、灌木丛、树林等地的杂草、自然落叶、枯枝落叶等。供试菌株中的黄孢原毛平革菌(菌株编号:CICC 40299)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC),康氏木霉(菌株编号:ACCC 32037)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)。培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。供试植物为浙江省生态型绿萝(Epipremnumaureum),由实验室自行培育。

种子液:将4 ℃保存的康氏木霉和黄孢原毛平革菌分别接种到PDA培养基上,在28 ℃条件下分别培养4、7 d,并转接活化2次。将活化后的菌株接种到相应的培养基中,黄孢原毛平革菌于28 ℃、150 r·min-1条件下振荡培养7 d,康氏木霉于28 ℃、150 r·min-1条件下振荡培养4 d,将菌种的孢子浓度控制在1×108CFU·mL-1备用。

固体培养基:取9个500 mL三角瓶,分别加入园林废弃物7 g、麸皮3 g,调节含水量至60%,另加(NH4)2SO43 g·L-1、KH2PO43 g·L-1、MgSO4·7H2O 2 g·L-1、NaNO30.3 g·L-1、FeCl30.5 g·L-1,121 ℃灭菌60 min。

1.2 试验设计

1.2.1 菌株共生兼容性试验

将康氏木霉与黄孢原毛平革菌点接入同一PDA平板上,28 ℃静置培养4 d,观察其生长情况,并进行生长优势比较。

1.2.2 混菌接种时序优化试验

选用含园林废弃物的固体培养基,设置3个接种组别,分别为黄孢组(接种黄孢原毛平革菌)、康氏组(接种康氏木霉),以及混菌组(接种黄孢原毛平革菌和康氏木霉)。其中,单菌组接种体积分数为20%的种子液。依据菌株兼容性试验确定的生长优势,混菌组初始以10%的接种量接种黄孢原毛平革菌种子液,并分别在其生长0、3、6 d后,以10%的接种量接种康氏木霉的种子液。在28 ℃、自然pH下进行混菌接种时间优化试验,依次在培养的6、8、10 d时测定各组的木质素和纤维素降解率,每组重复3次。

1.2.3 发酵条件优化试验

选用含园林废弃物的固体培养基进行单因素发酵试验:(1)调整固体培养基含水率分别至50%、55%、60%、65%、70%,统一接入康氏木霉、黄孢原毛平革菌比例为1.1∶2的菌液(先接种黄孢原毛平革菌,3 d后接种康氏木霉),接种量为14%,发酵10 d;(2)分别在固体发酵培养基中加入接种量为0、10%、12%、14%、16%、18%、20%的康氏木霉、黄孢原毛平革菌比例为1.1∶2的菌液(先接种黄孢原毛平革菌,3 d后接种康氏木霉),设定固体培养基的含水率为60%,发酵10 d;(3)分别在固体发酵培养基中加入康氏木霉、黄孢原毛平革菌比例为0.5∶2、0.7∶2、0.9∶2、1.1∶2、1.3∶2、1.5∶2的菌液(均先接种黄孢原毛平革菌,3 d后接种康氏木霉),设置固体培养基的含水率为60%,加菌量为14%,发酵10 d。

在单因素试验的基础上,设置3因素3水平的混菌接种发酵试验(表1),设定固体培养基的含水率(A)分别为50%、60%、70%(编码水平依次对应于-1、0、1),菌液中康氏木霉、黄孢原毛平革菌的比例(B)分别为1∶4、2∶4、3∶4(编码水平依次对应于-1、0、1),接种量(C)分别为10%、15%、20%(编码水平依次对应于-1、0、1),用范式洗涤纤维分析法分别测定发酵前后的木质素、纤维素含量,计算降解率,并以不同发酵条件下木质素、纤维素的降解率为响应值,建立回归方程,获得最佳发酵条件。

表1 发酵条件优化的Box-Behnken响应面试验设计

表2 单因素试验下不同水平对木质素、纤维素降解率的影响

1.2.4 堆腐试验

取适量的园林废弃物均分为对照组(CK)和试验组,制成长2 m、宽1.5 m、高1 m的堆体,向两组均添加3%的鸡粪。测定园林废弃物和鸡粪的初始含碳量和含氮量,利用尿素调节堆体的碳氮比为30,调节堆体含水率为60%。试验组先添加10%的黄孢原毛平革菌菌液,3 d后添加5%的康氏木霉菌液。在试验组添加菌液的同时期,CK组添加等量蒸馏水作为对照。试验共进行30 d,每天定时测定堆体温度,每5 d测定1次堆体营养成分(总腐殖酸、有效磷、碱解氮)和发芽指数。

1.2.5 绿萝栽培试验

试验共设置5个处理:J1,泥炭、蛭石、加菌堆腐产物以5∶3∶2的比例混合;J2,加菌堆腐产物、蛭石以7∶3的比例混合;CK1,泥炭、蛭石、未加菌堆腐产物以5∶3∶2的比例混合;CK2,未加菌堆腐产物、蛭石以7∶3的比例混合;CK3,泥炭、蛭石以7∶3的比例混合。选取长势相同的绿萝苗用于栽培试验,每盆栽种2株。移栽30 d后,分别测定各处理下绿萝的株高、根长、鲜重(整株)、干重(整株)等生长指标和叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)含量等生理指标。

1.3 指标测定

采用3 m钢卷尺测量株高、根长。参照范氏洗涤纤维分析法[12]测定木质素和纤维素含量。采用HI8424便携式酸度计[贝尔分析仪器(大连)有限公司]的温度探头测量堆体上、中、下部的温度,取平均值。参照行业标准HJ 615—2011《土壤 有机碳的测定 重铬酸钾氧化-分光光度法》测定有机碳和有机质含量;采用碱解扩散法和碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法[13]测定碱解氮、有效磷含量;采用焦磷酸钠浸提-K2Cr2O7容量法[14]测定总腐殖酸含量。参照Jin等[15]的方法测定发芽指数。参照胡秉芬等[16]的研究,采用分光光度法测定叶绿素a、b含量。

1.4 数据处理

采用SPSS 21软件开展单因素方差分析,对有显著(P<0.05)差异的,采用Duncan法进行多重比较。用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面优化分析。用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 固体发酵条件优化

2.1.1 菌株共生兼容性试验结果

将康氏木霉与黄孢原毛平革菌点接入PDA平板培养5 d后,康氏木霉的菌丝占据了大部分空间(图1),说明其生长活性优于黄孢原毛平革菌。因此,在混合发酵时考虑优先接种黄孢原毛平革菌。

图1 菌株共生兼容性试验结果

2.1.2 混菌接种时序优化结果

先接种黄孢原毛平革菌培养3 d或6 d后再接种康氏木霉培养10 d(分别标记为H3+K10、H6+K10),其对木质素、纤维素的降解率显著高于黄孢原毛平革菌或康氏木霉单菌培养16 d(分别标记为H16、K16)的结果,可见混合发酵的优势明显(图2)。虽然H3-K10与H6-K10的组合均能够实现较好的降解效果,但间隔3 d的安排更贴近速腐菌剂的要求。综上,本试验采用先接种黄孢原毛平革菌,3 d后接种康氏木霉培养10 d的方法进行发酵。在试验条件下,其对纤维素、木质素的降解率分别为25.57%、23.12%。

H3+K6代表接种黄孢原毛平革菌培养3 d后接种康氏木霉培养6 d。其余依此类似。H16、K16分别代表单独接种黄孢原毛平革菌、康氏木霉培养16 d。同一指标下柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。

2.1.3 单因素试验结果

单纯考查含水率的影响发现,当含水率为60%时,园林废弃物的纤维素和木质素降解率最高,分别达26.16%和25.28%。当含水量过低或过高时,均不利于菌种利用营养物质,会抑制菌种的生命活动。

单纯考查接菌量的影响发现,随着接菌量的增加,纤维素、木质素降解率总体呈先升后降的趋势,当接菌量为14%时达到峰值。当接菌量过低时,因接入的菌种过少,易导致废弃物发酵不完全;而当接菌量过高时,则会导致菌群大量消耗培养基中的营养物质,影响其正常生理活动和相关降解酶的合成。

单纯考查菌种比例的影响发现,当康氏木霉与黄孢原毛平革菌的比例为1.1∶2时,纤维素降解率和木质素降解率均最高,分别达到27.24%和24.51%,显著高于其他水平。

综上,初步确定含水率60%、接菌量14%,菌种比例1.1∶2的发酵条件较优。

2.1.4 响应面试验结果

响应面分析试验结果(图3)显示,纤维素降解率和木质素降解率均随着含水率、接菌量和菌种比例这3种因素相应水平的提高,呈现出先上升后下降的趋势,表明这3种因素间存在交互作用。为确定全局最优解,以纤维素降解率和木质素降解率最大为优化目标,根据Design-Expert 8.0.6软件的运行结果,确定最优条件为:含水率60.4%,接菌量14.9%,菌种比例0.55。在此条件下,模型预测的纤维素降解率和木质素降解率分别为30.97%、27.69%。将上述最优条件近似优化为含水率60%,接菌量15%,菌种比例1.1∶2进行验证试验,纤维素降解率为31.56%,木质素降解率为28.37%,与预测值偏差不大。

图3 响应面试验下不同因素对纤维素降解率、木质素降解率的影响

2.2 混菌堆腐效果评价

堆腐过程中,CK和试验组的温度都先迅速提高(图4)。与CK相比,添加菌剂的试验组会提前2 d进入高温期(50 ℃以上),堆腐6 d时即可达到最高温(52 ℃),而CK在7 d时的最高温为51 ℃。两组堆体的温度均从13 d左右开始下降,且以试验组的下降速率更快,说明其堆腐物中的大部分有机质已经被分解。与CK相比,试验组的高温持续时间久,分解速度较快,21 d后堆体温度即接近环境温度并持续一段时间,而CK在28 d时才降至环境温度。可见施加混菌可加速堆腐。

图4 堆腐过程中的温度变化

腐殖酸是由动植物残骸经微生物分解、转化,并伴随各种物化反应得到的有机物,其含量可以体现土壤品质和土壤肥力[17]。堆腐过程中,试验组和CK的总腐殖酸含量均呈现先下降后上升的趋势(表3),10 d时,试验组的总腐殖酸含量显著低于CK,但15 d及之后试验组的总腐殖酸含量反而显著高于CK,在30 d时达到最大值15.79%。这说明,添加混菌能够提升堆体有机碳转化为腐殖酸的能力。

表3 堆腐过程中物料营养成分与发芽指数的变化

碱解氮、有效磷可反映能被植物直接迅速利用或经过简单转化后可直接利用的氮、磷含量[18],其含量可以反映土壤肥力。试验组的有效磷含量在15 d时达最高值,与初始值相比增加了29.21%,碱解氮含量同样在15 d时达最高值,且二者均显著高于同时期的CK。这可能是因为,一方面,腐殖质的增加能够改善土壤结构,提高其保肥能力;另一方面,菌群的分解作用也有助于提高磷、氮元素含量,提升土壤肥力。

未腐熟完全的堆肥产品对植物有毒害作用,会阻碍植物生长甚至导致其死亡。通常认为,当发芽指数(GI)>80%时,可认为堆肥产品对植物没有明显的毒害[19]。随着时间推移,试验组与CK的发芽指数均逐渐提高,除20 d外,其他时候试验组的发芽指数均显著高于CK。至25 d时,试验组的GI已达80%以上,而CK在30 d时才达80%以上,说明添加混菌有助于加速堆腐的无害化进程。

2.3 堆腐产物替代泥炭对绿萝栽培的影响

对比J1与CK1、J2与CK2发现,添加混菌处理得到的产物与泥炭混合后作为基质,对植株生长有促进效果(表4)。与CK3相比,J1的株高、根长、单株干重、单株鲜重分别显著增加12.84%、9.14%、10.08%、15.58%,而J2、CK2的上述部分均不高于,甚至显著低于CK3、J1和CK1。从叶绿素含量判断,也同样以J1的效果最好,其叶绿素a含量与叶绿素(a+b)含量均显著高于其他处理。上述结果证明,用适量的堆腐产物部分代替基质中的泥炭有利于绿萝生长和叶绿素合成,但纯堆腐产物与蛭石混合的基质并不利于绿萝生长。在试验条件下,混菌堆腐后的基质与泥炭、蛭石按照2∶5∶3的比例混合,可用作绿萝生长的栽培基质。

表4 不同处理对植物生长指标和叶绿素含量的影响

3 讨论

本试验发现,当黄孢原毛平革菌与康氏木霉间隔3 d接种时,园林废弃物中的纤维素和木质素降解效果最佳。这与王永泽等[20]的报道相符。含水量对菌丝生长有较大影响,含水量过高或过低都会抑制菌株对营养物质的吸收,影响菌剂的生长活性[21],从而影响其对纤维素和木质素的降解。本试验在含水率50%～70%的范围内确定了最适含水量60%。这与黄磊等[22]的研究结果相似。接菌量会影响菌落生长时间。接种量过多,会导致培养基中的营养物质消耗过快;过少,则不利于降解。适宜的接菌量可以有效缩短菌落培养时间,提高降解效率。康氏木霉和黄孢原毛平革菌的功能和生长性能具有明显差异性,为取得最好效果,在堆腐前应确定适宜的接种比例。本研究在单因素试验的基础上采用响应面试验,明确了含水率60%、接菌量15%、康氏木霉与黄孢原毛平革菌1.1∶2的菌种比例,在此条件下,纤维素降解率和木质素的降解率均达到最佳水平,可用于堆腐。

温度能够影响堆肥进程,反映堆肥产品的腐熟度,是评价堆肥稳定性的重要指标[23]。随着堆料中的有机质分解加快,产热增多,堆温也不断升高。这有利于提高菌类的活性,促进有机质的降解,并释放热量。一般来说,堆肥过程中的温度变化可分为升温期、高温期(≥50 ℃)和降温期[24]。本试验中,试验组的堆体在5 d时即进入高温期,并持续5 d左右,后期降温较快;而CK较试验组迟2 d进入高温期,且高温期的持续时间也较短,至29 d才降至室温。这与李瑞琴等[25]对微生物发酵的研究结果类似。

腐殖酸、营养元素含量与发芽指数等指标均能反映堆肥产品的质量[26]。堆腐过程中,碱解氮和有效磷含量随时间推进呈先上升后稍降低的趋势,并以试验组的含量更高,说明添加混菌可加速园林废弃物的降解,产生更多的腐殖酸并释放营养成分。未腐熟的堆肥产品会对植物产生毒性,抑制植物种子发芽、根系生长,降低产量[27]。发芽指数是反映堆料影响种子根长和种子发芽率综合表现的敏感参数[28],是目前判定腐熟程度的权威指标[29]。本试验的结果表明,添加混菌能够加快堆腐进程,处理25 d后,GI值便达到80%以上,满足腐熟标准,与付冰妍等[30]的结果一致。本试验将混菌发酵体系用于堆腐,与CK相比,各指标均能更快达到腐熟标准。这初步证实,经黄孢原毛平革菌和康氏木霉混合体系处理的园林废弃物用作栽培基质具有可行性。

植株形态指标能反映植株长势,从而直观判断不同栽培基质对植物生长影响的差异[31]。叶绿素含量是衡量植株光合作用能力的重要指标,也可以反映植物的生长状况[32]。本研究结果表明,J1(泥炭、蛭石、加菌堆腐产物以5∶3∶2的比例混合)基质有利于绿萝的生长,其叶绿素含量也有明显增加。这与庾富文等[33]得到的结果类似。J2(加菌堆腐产物与蛭石以7∶3的比例混合)基质下绿萝的各项生长指标和叶绿素含量均不高于,多数情况下还显著低于CK3。这可能是因为,由纯堆腐产物与蛭石混合组成的基质电导率和孔隙度较高,保水保肥能力弱,不利于植物生长。同时,基质中含有过多的堆腐产物也可能对叶绿素含量起到抑制作用,不利于植物光合作用的进行。余韵等[34]在将园林废弃物用于楸树栽培的试验中也发现,当其施用量为10%时可以提升叶绿素含量,但当其施用量增至30%时,叶绿素含量反而低于对照组。综上,园林废弃物堆腐产物可以部分替代泥炭用于栽培植物,这与魏乐等[35]研究结果一致。试验条件下,泥炭、蛭石、加菌堆腐产物以5∶3∶2的比例混合制成的基质,可用于绿萝栽培,在促进植株生长、提高叶绿素含量等方面表现良好,具有一定的应用前景。同时,因其原料来源广、堆腐成本低,在园林废弃物资源化、泥炭资源节约保护等方面也有实质性的推广意义。