内质网应激与非酒精性脂肪性肝病肝损伤

曾伟兰 汪艳

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代谢综合征的肝脏表现。根据组织学特征,NAFLD分为非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH),部分可进展为肝硬化、肝癌。NAFLD是一种复杂的多因素疾病,涉及遗传、表观遗传和环境等多种因素,其发病机制仍未完全阐明。

肝细胞富含内质网(ER)。ER是真核细胞内区间体积最大的细胞器之一。蛋白翻译折叠、钙离子稳态、类固醇和脂质生物合成、囊泡运输等一系列生物学过程在ER发生。生理性或病理性刺激,如B细胞成熟、葡萄糖诱导胰岛素分泌、营养素剥夺、氧化应激、缺氧,以及遗传突变等都可能影响ER稳态,引起ER应激。一旦发生ER应激,细胞将启动未折叠蛋白反应(UPR),恢复ER稳态或执行细胞死亡。UPR可分为两种类型:当发生轻度或中度ER应激时,UPR清除未折叠或错误折叠的蛋白,恢复ER稳态,该过程称为“适应性”或“细胞保护性”UPR;当发生强烈或持续ER应激时,UPR过度激活,细胞内部凋亡机制启动,该过程称为“适应不良的/不受限的/终末的”UPR。此外,经典UPR是未折叠或错误折叠蛋白形成所引起3种UPR感受器活化。尽管游离饱和脂肪酸等刺激对蛋白折叠反应没有直接影响,但也可激活UPR感受器,这种情况称为非经典UPR[1]。

肝脏脂质异常累积为NAFLD主要起因。肝脂质累积通常与胰岛素抵抗(IR)同时发生,与肝细胞中ER相关的蛋白平衡紊乱有关。ER应激是NAFLD的主要触发因素之一。研究表明,ER功能障碍可以激活IR和炎症反应等一系列细胞内在应激途径,引起肝损伤或肝细胞死亡。因此,了解ER应激和UPR在NAFLD疾病发生中的作用将有助于发现NAFLD的新治疗策略。

哺乳动物细胞UPR由3种信号通路[也称为UPR分支(UPR branches)或UPR感受器)]组成,包括肌醇需要酶1(IRE1)、蛋白激酶R(PKR)样ER激酶(PERK)和激活转录因子6(ATF6)。葡萄糖调节蛋白78(GRP78,也称为BiP)和葡萄糖调节蛋白94(GRP94)是调节蛋白质量控制和降解的分子伴侣。在生理状态下,3种UPR感受器与GRP78结合而处于非活性状态;当ER腔内聚集未折叠或错误折叠蛋白时,这些异常蛋白会竞争性结合GRP78,将其从UPR感受器分子结构域上解离,引起这些感受器分子活化并级联激活下游信号通路。另外,ER腔内聚集的未折叠或错误折叠蛋白也会直接与UPR感受器结合,引起UPR感受器活化[1-2]。

研究表明在NASH患者肝活检样本、遗传和饮食诱导NAFLD小鼠模型中,均发现NAFLD发生与3种UPR感受器激活有关[3-5]。IRE1是定位于内质网的跨膜蛋白,同时具有蛋白激酶活性与核糖核酸内切酶(RNase)活性。在哺乳动物基因组中具有IRE1a和IRE1β两种亚型。IRE1a表达广泛,IRE1β仅在肠上皮细胞表达[6]。ER应激时,BiP从IRE1a脱离后,IRE1a发生寡聚化和自磷酸化(p-IRE1α)。p-IRE1α经自身RNase结构域的催化作用,使X-box 结合蛋白-1(XBP1)mRNA发生剪切作用,生成短XBP1 mRNA,短XBP1 mRNA翻译为有活性的XBP1s蛋白。XBP1s蛋白进入胞核激活一系列基因转录[如ER分子伴侣、ER分泌基因和ER相关蛋白降解系统(ERAD)作用的分子等)],促进未折叠或错误折叠蛋白运出ER,从而维持ER稳态。另外,IRE1a的RNase还可通过一个被称为RIDD(regulated IRE1-dependent decay)的过程降解特定的microRNA(miRNA)和mRNA,参与细胞的代谢、生存和死亡等过程[7-8]。

IRE1α-XBP1信号轴在NAFLD进程中激活,促进肝脂肪变性和炎症反应发生。Bax抑制剂-1(BI-1)是一种保守的ER驻留蛋白,可以抑制细胞死亡。有研究发现NAFLD小鼠在BI-1基因敲除后,可通过激活IRE1α RNase活性来促进肝脂肪变性,并且这一作用可被IRE1α核酸内切酶抑制剂STF-083010阻断[3]。在肥胖和糖尿病小鼠模型中,肝脏中BI-1 mRNA表达降低40%以上,而IRE1α的表达水平和IRE1α介导的XBP1剪切活性增加。使用腺病毒基因转移技术特异性恢复BI-1基因敲除的肥胖和糖尿病小鼠肝脏的BI-1水平,发现BI-1可与IRE1α形成复合物并严重钝化XBP1 mRNA的剪切活性,显著改善小鼠的葡萄糖耐受不良[9]。此外,活化的IRE1α可通过XBP1促进丝氨酸棕榈酰转移酶基因(SPT)的转录,刺激肝细胞释放富含神经酰胺的炎性细胞外囊泡(EVs),增加肝脏中巨噬细胞的募集,EVs将肝细胞ER应激传递给巨噬细胞,进一步加重高脂肪、高果糖和高胆固醇(FFC)饮食诱导的NASH小鼠发生炎症反应和肝损伤。相反,抑制肝细胞IRE1α表达,可减少FFC诱导NASH小鼠EVs释放和巨噬细胞聚集,减轻炎症和肝损伤[10]。这些结果提示,开发阻断IRE1α信号通路的抑制剂或靶向抑制EVs释放也许是NASH的潜在治疗策略。

然而,有研究发现,虽然肥胖小鼠肝脏中IRE1α磷酸化水平、c-Jun N端激酶(JNK)活性和UPR靶基因表达均增加,但是XBP1剪切活性仍然受损。Yang等[11]发现,一氧化氮合酶(iNOS)刺激瘦素缺陷型(ob/ob)肥胖小鼠和HFD饮食诱导NAFLD小鼠肝组织IRE1α发生S-亚硝基化(S-Nitrosylation)引起IRE1α RNase活性下降,导致IRE1a介导的XBP1剪接活性降低,并促进JNK活性增加。相反,通过抑制IRE1α的S-亚硝基化可以重新恢复肝脏中IRE1α表达以及XBP1剪接活性,降低JNK活性,改善NAFLD小鼠的葡萄糖稳态。这提示NAFLD疾病进程中,UPR感受器上游信号分子(如iNOS)激活也会影响IRE1α活性,可能导致ER功能受损和ER应激延长。

此外,在慢性ER应激中IRE1α可能对NAFLD疾病具有保护作用。Wang等[12]发现,HFD诱导的NAFLD小鼠和肝脂肪变性患者的肝组织中IRE1α发生S-亚硝基化诱导IRE1α RNase活性失活,同时参与肝脏脂质代谢的关键miRNA亚群水平上调,特别是miR-34和miR-200家族降解减少。与野生型HFD组小鼠相比,在肝细胞特异性敲除IRE1a基因(IRE1a-/-)的NAFLD小鼠肝组织,以及油酸或棕榈酸刺激的由IRE1a-/-小鼠分离的原代肝细胞中发现,肝细胞缺乏IRE1α可显著增加miR-34和miR-200家族的丰度,并且积累更多的中性脂质。因此猜测NAFLD时IRE1α RNase活性受损可能是由于S-亚硝基化的修饰。miRNA丰度的增加可能是IRE1α的RNase活性受损导致对miRNA降解减少。因此,IRE1α在NASH中的作用差异可能与IRE1α的RNase活性调节XBP1剪接水平和RIDD过程二者之间的平衡有关,但也不排除存在类似于BI-1等其他分子参与调控的可能性。值得注意的是,在营养限制或补充氧化剂的代谢饮食,如蛋氨酸和胆碱缺乏饮食(MCD),和致动脉粥样硬化饮食诱导小鼠的肝组织发生的急性ER应激,可能激活经典IRE1α-XBP1 UPR途径。相反,长期HFD饮食诱导的慢性ER应激可能导致NAFLD疾病小鼠肝组织发生IRE1α亚硝基化并抑制IRE1α RNase活性[12]。

PERK是真核翻译起始因子2α(eIF2α)激酶家族的成员之一。在ER应激中,PERK激活使eIF2α的Ser51位点发生磷酸化并降低蛋白翻译速度,限制新生蛋白向ER腔内转运,减少ER蛋白折叠负荷,起到保护细胞的作用。同时,PERK介导的eIF2α磷酸化可选择性允许某些mRNA(如激活转录因子4(ATF4))翻译。ATF4可通过激活编码抗氧化反应、氨基酸合成和转运必需的蛋白质等过程的UPR靶基因来促进细胞对ER应激的适应能力,导致细胞的死亡或生存。此外,CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP,也被称为DDIT3)可被ATF4转录激活,在ER应激促进细胞凋亡的过程中发挥关键作用。

PERK-eIF2α-ATF4信号通路调节NAFLD肝脂肪变性。Novoa等[13]发现,DNA损伤诱导蛋白34(GADD34,eIF2α特异性磷酸酶)可与蛋白磷酸酶1催化亚基结合,导致eIF2α去磷酸化,使DDIT3和ATF4水平降低,抑制UPR。Li等发现HFD诱导NAFLD小鼠、油酸刺激的HepG2细胞或妥布霉素(ER应激诱导剂)处理的3T3-L1细胞,在分别给予Salubrinal(eIF2α去磷酸化的选择性抑制剂)后,可以通过增加p-eIF2α和ATF4的表达,降低CHOP水平,抑制ER应激,同时增加LC3II/I(自噬标志物)和抑制p62(自噬底物)表达来促进自噬,最终起到缓解NAFLD肝脂肪变性的作用。然而在该研究中,ATF4水平升高的同时,CHOP表达却受到抑制[4],提示CHOP在NASH中作用的复杂性。与正常饮食野生型小鼠相比,Chop-/-小鼠在HFD饮食16周和MCD饮食3周的NASH模型中均出现更严重的肝损伤、炎症和脂肪变性。并且HFD组Chop-/-小鼠导致肝细胞凋亡数量和巨噬细胞活化数量显著增加[14]。由此推测,在脂毒性期间,CHOP可能依赖于促进巨噬细胞凋亡来减轻NASH小鼠的肝损伤。

ATF6是具有胞质bZIP(basic-leucine zipper)转录因子二聚化结构域的跨膜蛋白。在哺乳动物中具有ATF6a和ATF6β两种剪切体。在生理条件下,BiP与ATF6a结合并在ER驻留;当ER应激发生时,ATF6a从ER释放转运至高尔基体,并被高尔基体两种常驻加工酶(MBTP/S1P和MBTP/S2P)切割成具有转录活性片段的ATF6p50;ATF6p50再进入胞核激活UPR靶基因(如ER伴侣和其它参与蛋白质折叠的基因),增强细胞对ER应激的耐受能力和对未折叠蛋白的处理能力。ATF6p50还可与XBP1s结合形成异二聚体,促进内质网相关蛋白降解过程(ERAD)基因的上调。

ATF6α信号通路激活可能对NAFLD肝脂肪变性具有保护作用。ATF6p50可通过促进CHOP对CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)的负调控,来抑制脂质生成相关基因的表达,最终减少脂肪酸氧化和脂蛋白分泌。同时,ATF6p50过表达可抑制固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)的蛋白裂解[1]。有研究报道使用妥布霉素刺激小鼠(48 h)发生ER应激,发现野生型小鼠肝损伤能够自动恢复正常,ATF6α基因敲除小鼠表现出明显肝功能障碍和肝脂肪变性;并且显著抑制编码β-氧化(Cpt1a,Acadm)、过氧化物酶体(Acox1,Ppara)和微粒体氧化(Cyp4a10)关键步骤基因的表达[15]。ATF6α在NASH小鼠肝脏过表达可促进胰岛素信号传导[16]。然而,ATF6在妥布霉素诱导急性或慢性ER应激的NAFLD斑马鱼模型中作用有相反表现。当斑马鱼发生慢性ER应激时,ATF6可促进肝脂肪变性;相反,在急性ER应激时,ATF6可降低斑马鱼的脂肪变性[5]。因此,ATF6α在NAFLD肝脂肪变性的保护作用可能与ER应激的时长有关。

值得注意的是,除了每个UPR传感器都在NAFLD起作用外,脂毒性诱导ER应激反应,刺激其他下游分子的激活可加剧NAFLD脂质累积。溶酶体膜蛋白SID1跨膜家族成员2(SIDT2)基因敲除的小鼠肝组织不仅发生脂肪变性、肝小叶和汇管区炎症浸润,还发生ER应激和UPR激活,并伴有ER损伤。同时脂肪酸合成相关调控分子SREBP1蛋白和甾醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)mRNA水平显著升高[17]。Kim等在NASH患者和HFD饲喂MUP-uPA转基因小鼠诱导NASH模型发现,肝组织中ER应激诱导半胱天冬酶2(Casp2)表达上调,并与位点1蛋白酶(S1P)共定位,通过S1P的切割作用促进SREBP1/2转录因子激活,导致肝细胞中甘油三酯和游离胆固醇的蓄积更显著。相反,使用Casp2抑制剂(Ac-VDVAD-CHO)或基因敲除Casp2基因抑制NASH小鼠肝脏Casp2的表达可逆转ER应激诱导NASH的结局[18]。卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)缺乏不仅会影响脂蛋白组成和水平,而且会破坏细胞胆固醇稳态。与正常饮食小鼠相比,使用高脂高蔗糖(含36%脂肪不含胆固醇)依次诱导C57BL/6野生型、低密度脂蛋白(LDL)受体敲除(Ldlr-/-xLcat+/+,SKO)和LDL受体/LCAT双重敲除(Ldlr-/-xLcat-/-,DKO)NASH小鼠模型发现,野生型和SKO小鼠肝组织中不仅出现胆固醇生物合成基因,以及ER应激标志物CHOP和XBP1s的表达水平表达增加,还出现炎症小体活化;但在DKO小鼠中均无这些变化。然而,高胆固醇(2%)喂养DKO小鼠可以诱导小鼠肝组织发生脂肪变性和炎症小体活化[19]。这些结果提示NASH中,胆固醇的积累与ER应激和炎症小体激活相关。

另外,长寿因子(Sirtuins)参与调控细胞寿命进程、糖脂代谢、应激反应以及炎症反应等生理过程。Shin等[20]发现在ER应激发生时,SIRT7特异性靶向核糖体蛋白的启动子,可直接抑制Myc转录因子活性,沉默UPR相关基因表达,缓解内质网应激。与野生型小鼠相比,SIRT7基因敲除小鼠会加速NAFLD疾病进程;相反,抑制ER应激或MYC失活可减轻ER应激并改善NAFLD小鼠肝脂肪变性[20]。这一发现表明,靶向SIRT7-MYC信号通路可能逆转ER应激,预防NAFLD疾病。

综上所述,ER应激和UPR在NAFLD/NASH疾病进展中具有重要作用。ER应激反应并非总是朝着NASH病变方向进行;轻度和中度ER应激触发“适应性UPR”,可作为药物靶点减轻NAFLD疾病病理表现,恢复ER正常稳态;严重或持续的ER应激可导致UPR激活超负荷,并通过炎症、细胞死亡和EVs分泌等方式导致NASH肝损伤加重;但可能作为药物靶点来消除NAFLD进程中出现的癌变细胞。尽管目前已发现许多用于缓解轻度或中度ER应激或诱导严重ER应激的工具化合物[1],但是实现临床转化应用仍存在一定距离。未来研究还需考虑如何基于内质网靶向递药系统,利用当前的工具化合物开发出符合NAFLD临床安全给药的药物。此外,关于UPR感受器在NAFLD疾病进程中的作用研究仍比较缺乏,尚不能完全解释其错综复杂的关系网络对NAFLD进程的影响,还需进一步研究。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。