桑叶蛋白活性多肽的酶解制备

贾漫丽，杨雪，王彬彬，李娜，李季生，范伟*

（1.河北省高校特色蚕桑应用技术研发中心，河北 承德 067000；2.承德医学院蚕业研究所，河北 承德 067000；3.承德医学院 基础医学院，河北 承德 067000）

桑叶蛋白含量高、纤维含量低，不仅是传统优质粗饲料的来源，更是国家卫生部认定的功能性食品和药品重要来源的原料之一[1]。桑叶蛋白制备活性多肽的发展潜力巨大，生物活性多肽是一类含2～20 个氨基酸残基、对人体健康有益的蛋白短肽片段，一般其分子量均小于6 kDa[2]。孙崇臻等[3]研究发现，桑叶蛋白（mulberry leaf protein，MLP）组成成分主要为蛋白质和分子量大于6.5 ku 的大分子肽，大分子肽一般不活跃，通过酶解蛋白质的方法可获得0.6～6.5 ku 的多肽和0.3～0.6 ku 的小肽，而这些肽具备一定的抗炎、降压、抗氧化、免疫等生物活性。其中，降血压肽是目前较受关注的研究焦点之一[4]。血管紧张素转化酶（angiotensin I-convening enzyme，ACE）可抑制具有降压作用的缓激肽的分解，使血压升高。食源性ACE 抑制肽是一类大多源自食源性动物、植物、微生物等的天然蛋白多肽，可抑制ACE 活性，临床更安全、无不良反应，是目前ACE 抑制剂领域的新热点[5-6]。制备ACE 抑制肽的方法主要有蛋白酶酶解、分离提取、酸水解、发酵降解、化学法或脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）重组人工合成法等。其中酶解法为目前多肽制备的主要方法[7-8]，已在米渣、大豆、玉米、小麦等植物源蛋白制备ACE 抑制肽研究中取得了一定进展[9-11]。

抗氧化剂可以缓解自由基对机体产生的损伤，目前多为合成抗氧化剂，如丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚等，虽然非常高效且成本低，但因其具有潜在毒性和致癌风险导致其难以在医药、食品工业中应用[12-14]。抗氧化肽作为天然的生物活性肽，其结构简单、吸收性好、无免疫原性、性质稳定，且兼具抗氧化及降血压和抗癌等功效，因此其在食品及医药开发领域的应用前景广阔，也越来越受到人们的关注。因此，本研究以桑叶粉中提取的桑叶蛋白为底物，以碱性蛋白酶、中性蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶为内切酶酶源，以ACE 抑制活性为指标，采用单因素逐级优化的试验方法筛选制备桑叶活性肽的最佳条件，并探讨其抗氧化活性，为在临床及食品领域研发和应用兼具ACE 抑制和抗氧化活性的多功能桑源多肽提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜桑叶采摘于承德医学院桑树种质资源园，取中部叶位成熟叶，洗净，60 ℃干燥后粉碎过60 目筛（蛋白质含量198.98 mg/g），-20 ℃密封保存[15]。

碱性蛋白酶（≥200 U/mg，来源于地衣芽孢杆菌）：上海麦克林生化科技股份有限公司；中性蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、血管紧张素转化酶（A2580-0.5UN）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-his-leuhydrate，HHL）：默克Sigma 试剂公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、冰乙酸、乙腈（均为分析纯）：阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-2030 高效液相色谱仪（紫外检测器SPD-20AV）： 日本岛津公司；AR224CN 分析天平、STARTER3100 精密pH 计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；30ND 中式真空冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；H1850 台式离心机：湖南湘仪离心机有限公司；VELOCITY 18R 高速台式冷冻离心机：Dynamica公司；Micro Pure UV/UF 超纯水系统：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；BHS-4 数显恒温水浴锅：江阴保利科研器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑叶粗蛋白提取及多肽制备

粗蛋白提取参照杨晶等[16]的方法，精确称取100 g桑叶粉，按料液比1∶20（g/mL）加入去离子水2 000 mL，超声处理40 min，5 000 r/min 离心6 min，取上清液4 ℃冷藏过夜，用1 mol/L HCl 调至pH3.0 沉淀蛋白[15]，加去离子水重悬，调至pH7.0，10 000 r/min 离心5 min 得到沉淀，经低温冷冻干燥得到桑叶蛋白粉，参照GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》测定蛋白质含量为518.98 mg/g。蛋白多肽制备采用酶解法，将桑叶蛋白粉作为反应底物配制为一定浓度的溶液，按照与底物的质量比加入相应的蛋白酶，在适合的酶解温度下水解处理一定时间，依据设定的酶解条件调节pH值，酶解结束后立即沸水浴灭酶10 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液待测。

1.3.2 桑叶蛋白酶解过程水解度（degree of hydrolysis，DH）测定

采用pH-Stat 法[17]计算蛋白酶解过程的DH，DH 表示水解断裂的肽键数占总肽键数的百分比，计算公式如下。

A=（B×N）/（α×m×htot）×100

式中：A 为DH；htot为底物蛋白分子中所含肽键总数，桑叶蛋白7.883 mmol/g；B 为所消耗碱体积，mL；N为碱浓度，moL/L；α 为α-氨基酸平均解离度；m 为底物蛋白含量，g。

1.3.3 桑叶蛋白ACE 抑制肽的制备

碱性、中性、芽孢杆菌蛋白酶针对酶解pH 值、底物浓度、加酶量、酶解温度、酶解时间逐一优化，其他条件固定不变。设置底物浓度为5、10、15、20、30 g/L；加酶量为4.5%、6.0%、7.5%、9.0%、10.5%；pH 值为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；酶解时间为5、10、20、30、40、50、60、90 min；中性和碱性蛋白酶的酶解温度为40、45、50、55、60 ℃，芽孢杆菌蛋白酶酶解温度为50、55、60、65、70 ℃。以水解度和ACE 抑制活性为指标进行单因素试验。

1.3.4 桑叶蛋白ACE 抑制活性的测定

参照杨雪等[18]的方法并进行改进。酶解样品稀释5 倍后进行测定，10 μL 样品液中加50 μL 6.5 mmol/L HHL，37 ℃温育6 min，加入20 μL ACE（0.1 U/mL），37 ℃温育30 min 后，加入85 μL 1.0 mol/L HCl 终止反应。空白用10 μL 硼酸盐缓冲液代替。反应液经0.22 μm 滤膜过滤后采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC） 法测定生成马尿酸的含量。ACE 和HHL 溶液均采用硼酸盐缓冲液（0.1 mol/L，含0.3 mol/L NaCl、pH8.3）配制。HPLC 测定条件：Kromasail-C18 色谱柱，流动相为12%乙腈（含0.5%乙酸），柱温40 ℃，进样体积5 μL；检测波长228 nm；流速为1.0 mL/min。ACE 抑制活性的计算公式如下。

Y=（A-B）/A×100

式中：Y 为ACE 抑制活性，%；A 为空白组马尿酸的浓度，mmol/L；B 为样品组马尿酸的浓度，mmol/L。

1.3.5 桑叶蛋白抗氧化活性的测定

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力测定

DPPH 自由基清除率测定参照包黎明等[19]的方法。取酶解液1 mL，加3 mL DPPH 工作液，充分混匀，避光反应30 min，517 nm 测定OD 值。以95%乙醇为对照，以蒸馏水为空白，DPPH 自由基清除率计算公式如下。Y=[1-（A样品-A对照）]/A空白×100

式中：Y 为DPPH 自由基清除率，%；A样品为样品组517 nm 吸光度；A对照为95%乙醇在517 nm 下的吸光度；A空白为蒸馏水在517 nm 下吸光度。

1.3.5.2 T-AOC 测定

采用微量法，按试剂盒说明书进行操作，以Trolox 溶液为阳性对照，酶标仪在波长405nm 下读取各孔OD 值。

1.4 数据分析

数据使用Excel 进行统计，用SPSS 23.0 软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 制备桑叶多肽酶解条件的筛选

2.1.1 底物浓度对多肽ACE 抑制活性和水解度的影响

底物浓度对多肽ACE 抑制活性和水解度的影响见图1。

图1 底物浓度对多肽ACE 抑制活性和水解度的影响Fig.1 Effect of substrate mass concentration on ACE inhibitory activity and DH of MLP

底物浓度是影响蛋白酶酶解产物ACE 抑制活性的重要因素，由图1 可知，随着底物浓度的增加，3 种蛋白酶酶解产物的ACE 抑制活性逐渐升高。碱性蛋白酶酶解产物在底物浓度为5 g/L 时，ACE 抑制活性为31.65%，低于中性蛋白酶和芽孢杆菌蛋白酶酶解产物，当底物浓度增加到20 g/L 时，碱性蛋白酶酶解产物的ACE 抑制活性升高至75.07%，缩小了与其他两种酶酶解产物的差距，此时中性蛋白酶酶解产物ACE 抑制活性为81.26%，芽孢杆菌蛋白酶酶解产物ACE 抑制活性为78.16%。但3 种蛋白酶酶解产物在底物浓度30 g/L 与20 g/L 之间ACE 抑制活性均无明显变化，说明20 g/L 已经达到了桑叶蛋白酶解体系的饱和状态，因此可以将20 g/L 作为酶解体系的固定参数之一。桑叶蛋白DH 随着底物浓度的增加而逐渐升高，在相同底物浓度下，碱性蛋白酶酶解产物的水解度最高，其次是芽孢杆菌蛋白酶，中性蛋白酶的水解度最低。酶解产物ACE 抑制活性与水解程度并没有必然相关性，蛋白水解程度高并不代表适合分子量大小的活性多肽多，此外还存在产生的活性多肽被进一步酶解、降解而失活的可能性，因此，中性蛋白酶更适合桑叶蛋白中ACE 抑制活性肽的释放。

2.1.2 加酶量对多肽ACE 抑制活性和水解度的影响

加酶量对多肽ACE 抑制活性和水解度的影响见图2。

图2 加酶量对多肽ACE 抑制活性和水解度的影响Fig.2 Effects of different enzyme dosage on ACE inhibitory activity and DH of MLP

由图2 可知，3 种蛋白酶多肽酶解产物ACE 抑制活性随加酶量的增加而逐渐升高。碱性蛋白酶酶解产物在加酶量4.5%时ACE 抑制活性69.00%，在加酶量为10.5%时ACE 抑制活性增加到76.66%。芽孢杆菌蛋白酶酶解产物在加酶量为7.5%时，ACE 抑制活性达到80.61%。随着加酶量的增加，中性蛋白酶酶解产物ACE 抑制活性的变化不明显。3 种蛋白酶酶解产物对ACE 活性的抑制活性为中性蛋白酶>芽孢杆菌蛋白酶>碱性蛋白酶。随着加酶量的增加，蛋白水解度先升高后降低。加酶量为4.5%时，3 种蛋白酶酶解产物的水解度均较低，但中性蛋白酶酶解产物的水解度明显高于其他两种酶。当加酶量达到7.5%时，碱性蛋白酶、芽孢杆菌蛋白酶、中性蛋白酶酶解产物的水解度均达到平台期，分别为19.83%、15.49%和17.80%。加酶量继续增加，水解度呈不变或开始缓慢下降。因此，后续试验选择加酶量为7.5%。

2.1.3 酶解pH 值对多肽ACE 抑制活性和桑叶蛋白DH 的影响

酶解pH 值对多肽ACE 抑制活性和桑叶蛋白DH的影响见图3。

图3 酶解pH 值对多肽ACE 抑制活性和水解度的影响Fig.3 Effect of pH value of enzymatic hydrolysis on ACE inhibitory activity and DH of MLP

由图3 可知，酸性（pH6.0）环境下碱性蛋白酶酶解产物的ACE 抑制活性较低，仅为51.47%，低于中性蛋白酶和芽孢杆菌蛋白酶酶解产物，说明酸性环境不适合碱性蛋白酶的酶解。随着酶解pH 值的增加，ACE 抑制活性升高，在pH8.0 时达到峰值72.53%，pH 值继续增加，ACE 抑制活性下降，pH10.0 时降低到67.80%。中性蛋白酶和芽孢杆菌蛋白酶酶解产物均在pH7.0 时ACE 抑制活性达到最大值，分别为85.09%、77.35%，在pH6.0～10.0 之间酶解产物的ACE 抑制活性差异不显著（P>0.05）。随着酶解pH 值的增加，3 种蛋白酶酶解产物的水解度均呈逐渐上升趋势，在pH6.0～7.0 时，碱性蛋白酶酶解产物水解度较低，仅由3.08%上升到3.97%，而芽孢杆菌蛋白酶和中性蛋白酶酶解产物水解度均在10%以上，随着酶解pH 值的增加，碱性蛋白酶酶解产物的水解度快速升高，在pH8.0～9.0 时，3 种酶的酶解产物水解度基本持平。因此，pH8.0 是碱性蛋白酶的最佳蛋白酶解作用条件，而中性蛋白酶和芽孢杆菌蛋白酶酶解pH 值选择7.0。

2.1.4 酶解温度对多肽ACE 抑制活性和桑叶蛋白DH的影响

酶解温度对多肽ACE 抑制活性和桑叶蛋白DH的影响见图4。

图4 酶解温度对多肽ACE 抑制活性和水解度的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity and DH of MLP

温度是影响酶解效果的重要因素之一，由图4 可知，3 种蛋白酶酶解产物的ACE 抑制活性随温度升高呈先升高后下降的趋势。中性蛋白酶和碱性蛋白酶均在酶解温度55 ℃时，酶解产物的ACE 抑制活性最高，分别达到82.47%和72.50%，芽孢杆菌蛋白酶在60 ℃时，其酶解产物ACE 抑制活性最大，达81.88%。随着酶解温度的升高，酶解产物的水解度先升高后降低。温度40℃时，碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解产物的水解度分别为9.25%和14.72%，在酶解温度达到55℃时达到最高，分别为13.66%和21.59%，当温度达到60 ℃时酶解产物的水解度开始降低。芽孢杆菌蛋白酶在酶解温度60 ℃时，其酶解产物水解度达到最大值15.80%。因此，后续试验中芽孢杆菌蛋白酶的酶解温度选择60 ℃，中性蛋白酶和和碱性蛋白酶选择55 ℃。

2.1.5 酶解时间对桑叶蛋白水解度和多肽ACE 抑制活性的影响

酶解时间对桑叶蛋白水解度和多肽ACE 抑制活性的影响见图5。

图5 酶解时间对多肽ACE 抑制活性和水解度的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on ACE inhibitory activity and DH of MLP

由图5 可知，中性蛋白酶和芽孢杆菌蛋白酶酶解5 min 时，其酶解产物的ACE 抑制活性分别为73.81%和71.91%，酶解50 min 时中性蛋白酶酶解产物的ACE 抑制活性最大为81.23%，芽孢杆菌蛋白酶酶解产物ACE 抑制活性为81.12%，随着酶解时间的延长，ACE 抑制活性变化不显著。碱性蛋白酶酶解产物的ACE 抑制活性在各时间段均低于其他两种蛋白酶，酶解50 min 时ACE 抑制活性为71.03%，继续延长酶解时间，ACE 抑制活性无明显差异。结果表明中性蛋白酶和芽孢杆菌蛋白酶酶解产物ACE 抑制效果高于碱性蛋白酶。随着酶解时间延长，酶解产物的水解度逐渐升高，在5～30 min 时，蛋白水解速率较快，水解度呈显著上升趋势，随后水解速率逐渐减慢。碱性蛋白酶、中性蛋白酶酶解50 min 时酶解产物水解度分别达到18.42%、21.41%；芽孢杆菌蛋白酶酶解40 min 时酶解产物的水解度达到最高17.36%，随着时间延长，水解度变化不明显。因此，3 种蛋白酶的酶解时间均选择50 min。研究表明碱性蛋白酶酶解较长时间（>1 h）后，更多的残留疏水性氨基酸侧链基团暴露[3]，这也是本研究中90 min 时碱性蛋白酶酶解产物的ACE 抑制活性虽然远低于芽孢杆菌和中性蛋白酶，但其自身长时间还会有较大幅度升高的原因。

2.2 3 种蛋白酶酶解产生桑叶多肽的抗氧化能力

正常机体在衰老或者患病等状态下，机体的自由基含量上升，此时若吸收外源性抗氧化剂来提升机体抗氧化水平和自由基清除能力，可以有效地缓解氧化压力、预防疾病[20]。抗氧化剂有天然和人工合成两大类，均可通过捕获、中和自由基来清除其对人体的伤害，其中天然抗氧化剂临床应用可预防心脏病、延缓衰老等诸多功效。本研究在2.1 所述的优化不同蛋白酶反应条件制备ACE 工艺（表1）的基础上测定酶解液的DPPH 自由基清除率和T-AOC，结果见图6。

表1 3 种蛋白酶用量及反应条件Table 1 Dosage and reaction conditions of different proteases

图6 桑叶蛋白多肽DPPH 自由基清除率和T-AOC 的影响Fig.6 The effect of mulberry leaf protein peptide on DPPH free radical scavenging rate and T-AOC

由图6 可知，3 种蛋白酶酶解产物均具有一定的DPPH 自由基清除能力，碱性蛋白酶酶解产生蛋白多肽的DPPH 自由基清除能力为42.38%，低于芽孢杆菌蛋白酶和中性蛋白酶，芽孢杆菌蛋白酶和中性蛋白酶酶解液DPPH 自由基清除能力差异不显著（p>0.05）。酶解50 min 时，芽孢杆菌蛋白酶DPPH 自由基清除率为79.44%，中性蛋白酶DPPH 自由基清除率为80.70%。已有研究表明在酶解时间较短时，中性蛋白酶酶解产物的抗氧化能力强于碱性蛋白酶[3，15]，而碱性蛋白酶需较长酶解时间（>1 h），才能暴露更多的疏水氨基酸的剩余侧链基团，由于中性蛋白酶的初始水解能力较强，因此中性蛋白酶比碱性蛋白酶具有更强的DPPH 自由基清除能力。酶解50 min 碱性蛋白酶酶解产物总抗氧化能力（2.91 mmol/g）与芽孢杆菌蛋白酶酶解产物的总抗氧化能力（3.08 mmol/g）无明显差异。中性蛋白酶酶解产物的总抗氧化能力最强，为4.47 mmol/g，显著高于芽孢杆菌蛋白酶和碱性蛋白酶（p<0.05）。

3 结论

研究发现碱性蛋白酶、中性蛋白酶和芽孢杆菌蛋白酶酶解桑叶蛋白的多肽混合产物均具有ACE 抑制活性，可作为制备桑叶蛋白来源的ACE 抑制肽的有效蛋白酶。分析pH 值、加酶量等5 个因素对DH、ACE 抑制活性的影响，得到了3 种蛋白酶酶解桑叶蛋白制取活性肽的最佳工艺条件。其中，底物浓度对DH 和ACE 抑制活性的影响最大，因为酶量一定的酶促反应中，在一定限度内底物的量与速率会呈现正相关关系。超过该限度后，底物浓度增加，反应速率不再加快，酶的作用位点均已经饱和，基本达到平台期。研究进一步分析了3 种蛋白酶最佳酶解条件下酶解产物的抗氧化能力。3 种酶的产物混合多肽均具有一定抗氧化能力，其中中性蛋白酶酶解产物的总体抗氧化能力显著优于芽孢杆菌蛋白酶和碱性蛋白酶，可进一步用作桑叶蛋白抗氧化多肽的制备酶。

通过评价桑叶蛋白3 种蛋白酶酶解产物的ACE抑制活性及抗氧化能力，为多用途、深层次、高附加值开发利用桑叶蛋白资源，缓解优质蛋白资源的需求及提高桑树的经济效益均具有重要意义，同时也为进一步开发利用桑叶蛋白多肽提供理论依据。由于蛋白酶种类不同其具有的酶切位点也不尽相同，其多肽混合产物也具有功能可选择性多、供研究领域广泛的特点，今后可依据不同的研究目的而对其肽混合产物进行分离纯化、结构分析以及功能性评价。