莪术醇通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路介导的自噬抑制乳腺癌细胞的增殖活性

亓新峰，冯绪强，王建凤

（1.济南市第二妇幼保健院药剂科，山东济南 271100；2.高密市中医院药剂科，山东高密 261599）

莪术是我国传统中药，具有行气破血、消积止痛等功效，在多种疾病发生发展过程中发挥抗炎、抗氧化等多种药理作用[1-2]。莪术中富含挥发油，具有良好抗炎、抗病毒及抗肿瘤活性，莪术醇是莪术挥发油的主要成分之一，已被证实在鼻咽癌、肝癌中具有抗肿瘤效果[3-4]。另外，也有研究表明，莪术醇对乳腺癌细胞具有增殖抑制作用，但其具体作用机制尚不明确[5]。自噬是细胞维持生存的重要机制之一，通过吞噬自身异常或受损的蛋白、细胞质或细胞器，维持细胞稳态。自噬在肿瘤中既可发挥促癌作用，亦可通过多种途径发挥抑瘤作用。研究显示，在电离辐射等应激条件下，可诱导乳腺癌细胞自噬，调控相关信号通路，诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用[6]。本研究通过莪术醇作用于乳腺癌细胞，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响，并从自噬角度探索其作用机制，旨在为临床开发莪术醇抗乳腺癌相关药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

人乳腺癌细胞株MCF-7，购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 药物、主要试剂和仪器

莪术醇（≥96.7%）购自海门德思行药业科技有限公司，Annexin Ⅴ凋亡试剂盒购自美国BD Bioscience公司，单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）自噬检测试剂盒购自美国Sigma公司，Hoechst 33258染色试剂盒购自北京吉美生物技术有限公司，740Y-P购自美国medchemexpress公司；兔抗人Beclin1，p62，微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）B、脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、p-Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR 一抗和HRP 标记的山羊抗兔IgG 均购自美国Abcam 公司。MK3 酶标仪购自美国Thermo 公司，Power PAC2000 电泳仪和Gel Doc EZ 凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad 公司，Cytomics FC 500 流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司，BX51TF荧光显微镜购自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

MCF-7 细胞置于37 ℃水浴锅中复苏，接种于RPMI 1640 培养基（含有体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素），置于体积分数5% CO2培养箱中，37 ℃条件下培养，选取生长良好对数增殖期细胞用于后续实验。

1.2.2 MTT 法检测不同浓度莪术醇对MCF-7 细胞增殖的影响

使用无水乙醇溶解莪术醇，配制成1×104μmol/L浓度的母液备用。取对数增殖期MCF-7细胞，PBS重悬后调整细胞密度为1×105个/mL，接种于96孔板，细胞融合达80%时，加入12.5、25、50、100、200 μmol/L浓度的莪术醇（使用RPMI 1640培养基稀释），另设不含莪术醇的空白组，各设5 个复孔。培养24 h 后，每孔避光加入5 g/L 的MTT 溶液20 μL，孵育4 h 后弃去上清，每孔加入150 μL 的DMSO，充分振荡10 min，使用酶标仪于490 nm 处读取各孔吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率，增殖抑制率=（1-药物组A值/空白组A值）×100%，计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 细胞分组

取对数增殖期MCF-7 细胞，分为对照组、莪术醇组、740Y-P 组和莪术醇+740Y-P 组，莪术醇组加入50 μmol/L 的莪术醇，740Y-P 组加入10 μmol/L 的740Y-P，莪术醇+740Y-P 组分别加入上述浓度莪术醇和740Y-P，继续培养24 h。

1.2.4 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

调整各组细胞密度为4×102个/mL，接种于培养皿，每2 d 换液1 次，培养14 d 后，弃去培养基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%结晶紫染色20 min，吸出染色液，PBS 清洗，晾干，拍照观察，计数每组细胞克隆形成数。

1.2.5 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况

取各组细胞，调整细胞密度1×105个/mL，接种于6 孔板中，培养24 h 后，弃去培养液，胰酶消化，PBS清 洗2 次，4% 多聚甲醛固定15 min，加入5 μL Hoechst 33258 染液和5 μL PI 染液，4 ℃孵育30 min，荧光显微镜观察细胞凋亡情况，显示蓝色荧光表示细胞凋亡。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率

各组细胞调整密度为1×105个/mL，接种于6孔板，24 h后，收集各组细胞，胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，PBS 清洗，加入100 μL Binding Buffer重悬细胞，加入195 μLAnnexin-Ⅴ4 ℃摇床避光孵育15 min，加入5 μL PI染液混匀，4 ℃孵育5 min。上流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。重复3次，取平均值。

1.2.7 MDC染色观察细胞自噬

各组细胞调整密度为1×105个/mL，接种于6 孔板，24 h 后，弃去培养基，PBS 清洗，加入0.05 mml/L的MDC 染液，37 ℃孵育60 min，弃去染液，PBS 清洗，荧光显微镜下观察细胞自噬情况，细胞内出现点状荧光染色表示为自噬泡。

1.2.8 Western blot检测细胞中相关蛋白表达

收集各组细胞，胰酶消化，PBS 洗涤，加入RIPA细胞裂解液充分混匀，置于冰上裂解，12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA 法测定蛋白浓度。100 ℃水浴5 min 使蛋白变性，加样、进行SDS-PAGE 凝胶电泳，转至PVDF膜，将条带放入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST 洗 膜15 min×2 次，将膜放入稀释好的PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、p62、LC3B 一抗中，4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜15 min×3次，将膜放入稀释好的HRP 标记的二抗中，室温摇床孵育2 h，TBST 洗膜15 min×3 次。将ECL 工作液滴入PDVF 膜上，避光孵育3 min，放入凝胶成像系统，曝光显影，Image J软件分析各条带灰度值，以目的蛋白和内参GAPDH 蛋白条带灰度比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS25.0软件对数据进行分析，计量资料

2 结果

2.1 不同浓度莪术醇对MCF-7细胞的增殖抑制作用

随着莪术醇浓度升高，细胞增殖抑制率增加，呈剂量依赖性（P＜0.05），见图1。莪术醇作用于MCF-7 细胞的IC50为50.63 μmol/L，后续实验选取莪术醇浓度为50 μmol/L。

图1 不同浓度莪术醇对MCF-7细胞的增殖抑制作用

2.2 各组细胞克隆形成数比较

与对照组（113.69±12.16 个）比较，740Y-P 组细胞克隆形成数（184.13±8.52 个）增加，莪术醇组细胞克隆形成数（26.19±7.58 个）减少（P＜0.05）；莪术醇+740Y-P组细胞克隆形成数（52.47±10.82个）较740Y-P组减少，较莪术醇组增加（P＜0.05）。见图2。

图2 各组细胞克隆形成结果

2.3 Hoechs 33258染色结果

荧光显微镜下可见，对照组和740Y-P 组细胞数量较多，蓝色荧光较弱，生长良好，染色均匀，凋亡细胞较少；莪术醇组细胞数量减少，可见大量较强蓝色荧光，细胞形态皱缩，发生解体；莪术醇+740Y-P 组细胞数量较莪术醇组增加，可见较多蓝色荧光，部分细胞解体。见图3。

图3 各组细胞Hoechs 33258染色结果（×100）

2.4 各组细胞凋亡率比较

与对照组（[3.21±0.74）%]比较，740Y-P 组细胞凋亡率[（1.65±0.68）%]降低，莪术醇组细胞凋亡率（[25.68±1.47）%]升高（P＜0.05）；莪术醇+740Y-P 组细胞凋亡率（[12.27±1.36）%]较740Y-P 组升高，较莪术醇组降低（P＜0.05）。见图4。

图4 各组细胞流式细胞术检测结果

2.5 MDC染色结果

MDC 染色显示，对照组、740Y-P 组荧光强度较弱；莪术醇组出现大量绿色荧光增强的自噬泡，莪术醇+740Y-P组自噬泡较莪术醇组减少。见图5。

图5 各组细胞MDC染色结果（×400）

2.6 各组细胞中自噬相关蛋白表达水平比较

Beclin1、p62、LC3Ⅱ/LCⅠ在各组之间存在差异。与对照组比较，740Y-P 组细胞中Beclin1 蛋白表达水平、LC3Ⅱ/LCⅠ降低，P62 蛋白表达水平升高，莪术醇组细胞中Beclin1 蛋白表达水平、LC3Ⅱ/LCⅠ升高，P62 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；莪术醇+740YP 组细胞中Beclin1 蛋白表达水平、LC3Ⅱ/LCⅠ较740Y-P 组升高，较莪术醇组降低，p62 蛋白表达水平较740Y-P 组降低，较莪术醇组升高（P＜0.05）。见表1，图6。

表1 各组细胞中自噬相关蛋白表达水平比较

图6 各组细胞中自噬相关蛋白表达电泳图

2.7 各组细胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相关蛋白表达水平比较

除Akt和mTOR 外，其他检测指标在各组之间存在差异。与对照组比较，740Y-P 组细胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达水平升高，莪术醇组细胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；莪术醇+740Y-P 组细胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达水平较740Y-P 组降低，较莪术醇组升高（P＜0.05）。见表2，图7。

表2 各组细胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相关蛋白表达水平比较（，n=5）

表2 各组细胞中PI3K/Akt/mTOR 通路相关蛋白表达水平比较（，n=5）

注：（1）与对照组比较，P＜0.05；（2）与740Y-P组比较，P＜0.05；（3）与莪术醇组比较，P＜0.05。

图7 各组细胞中PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达电泳图

3 讨论

乳腺癌细胞通过无限增殖，促进肿瘤生长，侵袭邻近组织和器官，向远处转移，并可对传统化疗药物产生抗药性，影响治疗效果，预后不佳。自噬参与肿瘤细胞生存、分化等多个生理过程，在维持细胞稳态过程中发挥重要作用。同时有研究显示，自噬可消化水解毒性蛋白，与肿瘤细胞耐药密切相关[7]。自噬与凋亡存在相互关系，参与调控肿瘤细胞凋亡过程，通过诱导自噬，提高肿瘤细胞自身降解，进而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，辅助增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，对于临床治疗肿瘤具有重要意义[8]。

莪术醇活性广泛，可通过调控相关促癌或抑癌基因表达、减弱肿瘤组织血管生成能力、影响细胞分化，抑制肿瘤细胞增殖，阻止肿瘤发生侵袭和转移，具有明显抗肿瘤活性[9]。本研究采用不同浓度莪术醇作用于MCF-7 细胞，结果显示，莪术醇以剂量依赖方式不同程度抑制细胞的增殖，证实了莪术醇对乳腺癌细胞的增殖抑制作用。Ning 等[10]报道，莪术醇可调节微小RNA 表达，抑制黑色素瘤小鼠肿瘤细胞增殖和转移。Cai 等[11]研究表明，莪术醇可增加塞来昔布对非小细胞肺癌的抑制作用，减少肺组织肿瘤转移结节。本研究采用克隆形成实验、Hoechst33258染色及流式细胞术分别检测细胞克隆形成能力、形态改变及凋亡情况，结果显示莪术醇组细胞克隆形成数较对照组明显减少，细胞形态发生明显改变，凋亡率明显升高，进一步证实莪术醇可抑制乳腺癌细胞增殖并促进细胞凋亡。

自噬通过在溶酶体中降解内吞蛋白质或受损细胞器，提供能量来源，有助于细胞生存，然而过度自噬可导致细胞自噬性死亡，对细胞具有促进生存及诱导死亡的双重作用。激活自噬被认为是抗肿瘤的新途径，通过增加细胞自噬通量，促进细胞死亡，可有针对性地逆转乳腺癌细胞耐药性，发挥抗肿瘤作用[12]。Beclin1 蛋白参与介导吞噬泡的形成，其表达降低则自噬体形成受限；LC3B 是检测自噬活性标志性蛋白，包括Ⅰ型和Ⅱ型，发生自噬时，LC3 Ⅰ经泛素样修饰形成LC3 Ⅱ，LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ与自噬活性密切相关；p62 蛋白可反映自噬的强弱，与自噬水平呈负相关。本研究结果显示莪术醇组细胞MDC 染色自噬水平，Beclin1 蛋白表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ较对照组明显升高，p62 蛋白表达明显降低，提示莪术醇可诱导MCF-7 细胞发生自噬，可能是其抑制细胞增殖诱导细胞凋亡的相关机制之一。Zhang 等[13]证实，在骨肉瘤MG-63 细胞中，莪术醇可通过诱导自噬，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。此外，刘发英等[14]研究显示，莪术醇在宫颈癌-HCC94 细胞中同样可发挥诱导自噬，促进凋亡的作用。本研究结果与以上研究一致，提示莪术醇通过诱导自噬，增加MCF-7 细胞自噬通量，促进自身降解，发挥潜在抗肿瘤作用。

PI3K/Akt/mTOR 信号通路广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等过程，与肿瘤细胞自噬密切相关，抑制该通路是抗肿瘤的重要途径。PI3K 是上游通路关键信号分子，参与调节细胞增殖和细胞周期，Akt 是PI3K 下游重要靶蛋白，可被其磷酸化活化为p-Akt，进一步激活下游mTOR 为p-mTOR，抑制细胞自噬和凋亡，促进肿瘤细胞增殖和细胞周期进程加速，在肿瘤形成及侵袭过程中发挥关键作用[15]。莪术醇通过何种机制诱导MCF-7 细胞自噬，尚需进一步研究探讨，本研究使用PI3K 激活剂740Y-P 干预MCF-7 细胞，结果显示PI3K/Akt/mTOR 信号通路激活，细胞自噬被抑制，而莪术醇组PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达较对照组明显下降，自噬水平升高，提示莪术醇可能具有抑制该通路激活自噬的作用。进一步在莪术醇干预的基础上联合使用740Y-P，结果显示，740Y-P可减弱莪术醇对PI3K/Akt/mTOR 信号通路的抑制作用，同时自噬相关蛋白表达也发生明显逆转，结果证实莪术醇可抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路，提示莪术醇抑制MCF-细胞增殖、诱导细胞凋亡，可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路介导的自噬有关。

综上，莪术醇可抑制乳腺癌MCF-7 细胞增殖，促进细胞凋亡，可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白表达，进而激活自噬有关，这可为临床乳腺癌相关药物开发提供实验依据。此外，本研究仅局限在细胞水平，尚需在动物实验进一步验证以上结论。