己酮可可碱灌胃对急性肝性脑病大鼠脑水肿的改善作用及其机制

罗妙莎，罗玉梅，冯云，和水祥

西安交通大学第一附属医院消化内科，西安 710061

肝性脑病是肝脏疾病引发的神经精神异常综合征，是严重肝脏疾病较为常见的并发症之一。急性肝性脑病为急性肝功能衰竭相关肝性脑病，多数患者无明显诱因及前驱症状，出现急性肝功能衰竭的临床症状，并可在短期内由轻度意识障碍迅速陷入深度昏迷，甚至导致死亡。急性肝性脑病的主要病理生理特征是脑水肿，脑水肿发展的颅内高压甚至脑疝已成为急性肝衰竭患者最主要的死亡原因之一［1］。然而目前针对急性肝性脑病的治疗方法较为局限，因此开发新的药物有助于改善患者的治疗现状［2-3］。水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）是水通道蛋白家族中的一员，在大脑中分布广泛，参与调节水分子的跨膜转运，维持脑组织内水的平衡，在脑水肿的形成与消散过程中发挥着重要作用［4］。研究［5］发现，在肝性脑病动物模型中检测到AQP4的表达升高，提示其在肝性脑病脑水肿的发生中起到重要作用。甲基黄嘌呤衍生物己酮可可碱是一种磷酸二酯酶抑制剂，具有多种药理作用，最初用于末梢循环障碍的治疗。随着研究的不断深入，发现其不仅是一种外周血管扩张剂，还具有较强的抗炎、抗免疫反应及抗纤维化作用，其临床应用范围也越来越广泛［6-8］。近来研究［9-10］发现，己酮可可碱可通过抑制氧化应激反应、减少血管内皮细胞损伤，减轻脑缺血/再灌注损伤的脑水肿程度。但国内外有关己酮可可碱对急性肝性脑病及其脑水肿的作用研究鲜有报道。2021年9月1日—2022年8月31日，本研究通过制备急性肝性脑病大鼠模型，观察了己酮可可碱灌胃对急性肝性脑病大鼠脑水肿的改善作用，并探讨其作用机制，从而为临床治疗急性肝性脑病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 大鼠、药物、试剂及仪器 健康清洁级雄性Sprague Dawley（SD）大鼠60只，体质量（150 ± 20）g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（陕）08-018。实验动物在恒温恒湿自然光线交替环境下给予自来水和普通啮齿类动物饲料喂养。所有动物实验均符合西安交通大学医学部动物实验中心管理委员会有关实验动物管理和使用的规定。水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司，硫代乙酰胺、己酮可可碱、伊文思蓝购自Sigma公司，兔抗大鼠AQP4抗体购自英国Abcam公司，RNA提取试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒购自日本TaKaRa公司，TNF-α ELISA试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒购自武汉赛培生物，高速低温离心机购自德国Eppendorf公司，酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司，PCR仪、垂直电泳槽、凝胶成像分析系统、Western 显像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 动物分组、急性肝性脑病大鼠模型制备及己酮可可碱给予方法 将60只健康清洁级雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组，每组12只。实验第1～3天，模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组给予硫代乙酰胺（Thioacetamide， TAA）200 mg/（kg·d）腹腔注射，连续注射3 d，制备急性肝性脑病大鼠模型；对照组给予等体积生理盐水腹腔注射。实验第4天起，己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠分别给予己酮可可碱50、100、200 mg/（kg·d）灌胃，模型组及对照组给予等体积蒸馏水灌胃，连续7 d。为防止可能造成的低血糖、低血钾及脱水症状，将大鼠饮用水调至含有0.23% NaCl、2.5%葡萄糖、0.1% KCl的混合溶液。

1.3 各组大鼠肝性脑病症状观察

1.3.1 各组大鼠一般情况观察 整个实验期间密切观察各组大鼠饮食、精神、运动、毛色等基本情况，连续7 d灌胃结束后称取各组大鼠体质量。

1.3.2 各组大鼠精神状态观察 采用高架十字实验。将大鼠置于中央平台处，使其头部面向其中一个开放臂，释放后即开始记录5 min内开臂进入次数百分比和开臂滞留时间百分比。

1.3.3 各组大鼠自发运动能力观察 采用开场实验。测试前将大鼠单独放置于实验场适应环境30 min，开始检测时将大鼠放于敞箱中央，由检测系统自动记录5 min内活动状态，测量指标为大鼠平均每分钟自发运动距离以及中央活动时间百分比。

1.3.4 各组大鼠空间学习记忆能力观察 采用Morris水迷宫实验。将平台随机置于某一象限中央，将大鼠从平台所在象限的对侧处头朝下放入水中，由水池上空的监控系统跟踪并记录大鼠游泳轨迹，每次测试上限时间为120 s。若未找到平台，则将大鼠手动置于平台上停留20 s。当大鼠爬上平台或设定的训练时间已到时，计算机停止跟踪记录并自动计算出找平台所需的时间，即寻台潜伏期。

1.4 各组大鼠肝功能指标观察 最后一次给药间隔12 h后，给予10%的水合氯醛3～4 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，血样标本送至西安交通大学第一附属医院检验科，应用全自动生化分析仪检测肝功能指标，包括血氨、ALT、AST。

1.5 各组大鼠脑水肿情况观察

1.5.1 各组大鼠血脑屏障通透性观察 大鼠迅速断头取脑，取同侧半球称湿重后置于甲酰胺（1 mL/100 mg脑组织）中，37 ℃避光孵育48 h，1500 r/min离心15 min，吸取上清液，酶标仪测定波长为632 nm处的OD值，绘制标准曲线，测算EB含量。大鼠血脑屏障通透性以大鼠脑内EB含量表示。

1.5.2 各组大鼠脑组织含水量测算 处死大鼠后，迅速取出完整脑组织，取同侧大脑半球，除去嗅球、脑干、小脑，电子天平准确称得湿重后置于100 ℃电热恒温干燥箱中烘烤48 h至恒重，两次称重误差小于0.2 mg后称取干重，计算脑组织含水量。脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.6 各组大鼠脑组织中AQP4 mRNA和蛋白检测 ①采用实时定量PCR法检测AQP4 mRNA。取脑组织加入TRIzol试剂提取RNA，将RNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增。引物序列如下：AQP4正向引物为5'-AGGCAATGTGTGCACTGCTCTAAC-3'，反向引物为5'-GAAGGTGTCAACGTCACACAACAA-3'；GAPDH正向引物为5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，反向引物为5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'。反应条件：预变性95 ℃、3 min ，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s共40个循环。以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。②采用Western blotting法检测AQP4蛋白。将取样脑组织用眼科剪剪切成细小的碎片，加入裂解液（1 mL/100 mg脑组织）裂解提取总蛋白，BCA法测定蛋白定量。配制分离胶盒浓缩胶，上样后电泳、转膜、脱脂奶粉封闭。加入一抗，4 ℃孵育过夜，次日加入二抗，室温下孵育1 h。Image J软件分析目的蛋白与内参蛋白的灰度比值，作为目的蛋白的相对表达量。

1.7 各组大鼠脑组织中炎症因子TNF-α、IL-1β检测 采用ELISA法。取2块脑皮质加入冷PBS进行匀浆，12000 r/min离心20 min，取上清，用ELISA试剂盒测定TNF-α和IL-1β水平，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.8 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝性脑病症状比较

2.1.1 各组大鼠一般情况比较 对照组大鼠活动自如，自由饮食饮水；模型组和己酮可可碱低剂量组大鼠毛色蓬乱、黯淡、不光洁，活动减少，精神萎靡，食欲不振，对外界刺激反应迟钝；己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组较模型组大鼠一般情况有所好转。

对照组和模型组大鼠体质量分别为（250.7 ±11.2）g、（185.6 ± 10.4）g，两组相比，P＜0.05。模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠体质量分别为（185.6 ±10.4）g、（190.1 ± 9.2）g、（228.8 ± 13.1）g、（241.0 ±12.9）g，其中己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠体质量均高于模型组（P均＜0.05）。

2.1.2 各组大鼠精神状态比较 对照组和模型组大鼠开臂进入次数百分比、开臂滞留时间百分比分别为19.86% ± 3.07%、15.73% ± 2.64%和10.01% ± 1.86%、5.19% ± 1.15%，两组相比，P均＜0.05。

模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠开臂进入次数百分比分别为10.01% ± 1.86%、11.34% ± 2.51%、13.49% ± 2.18%、17.37% ± 2.46%，其中己酮可可碱高剂量组大鼠开臂进入次数百分比高于模型组（P＜0.05）。模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠开臂滞留时间百分比分别为5.19% ± 1.15%、7.22% ±2.48%、8.81% ± 2.45%、11.99% ± 3.03%，其中己酮可可碱高剂量组大鼠开臂滞留时间百分比高于模型组（P＜0.05）。

2.1.3 各组大鼠自发运动能力比较 对照组和模型组大鼠平均每分钟自发运动距离、中央活动时间百分比分别为（22.13 ± 1.99）m、5.92% ± 0.33%和（12.59 ± 2.81）m、2.12% ± 0.45%，两组相比，P均＜0.05。

模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠平均每分钟自发运动距离分别为（12.59 ± 2.81）m、（15.27 ± 2.04）m、（16.80 ± 1.75）m、（19.91 ± 1.24）m，其中己酮可可碱高剂量组大鼠平均每分钟自发运动距离高于模型组（P＜0.05）。模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠中央活动时间百分比分别为2.12% ± 0.45%、3.55% ±1.01%、4.79% ± 1.56%、5.28% ± 0.71%，其中己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠中央活动时间百分比均高于模型组（P均＜0.05）。

2.1.4 各组大鼠空间学习记忆能力比较 对照组和模型组大鼠寻台潜伏期分别为（13.98 ± 3.31）s、（69.10 ± 5.28）s，两组相比，P＜0.05。

模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠寻台潜伏期分别为（69.10 ± 5.28）s、（60.37 ± 4.96）s、（58.29 ± 5.15）s、（39.41 ± 4.08）s，其中己酮可可碱高剂量组大鼠寻台潜伏期较模型组明显缩短（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠血氨、ALT、AST水平比较 对照组大鼠血氨、ALT、AST水平分别为（42.2 ±8.1）µmol/L、（43.7 ± 7.06）U/L、（110.1 ± 13.3）U/L，模型组大鼠血氨、ALT、AST水平分别为（196.7 ±19.3）µmol/L、（355.4 ± 23.9）U/L、（520.0 ±26.4）U/L，两组相比，P均＜0.05。

模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠血氨水平分别为（196.7 ± 19.3）µmol/L、（189.0 ± 13.2）µmol/L、（174.6 ± 16.4）µmol/L、（168.3 ± 15.8）µmol/L，其中己酮可可碱高剂量组大鼠血氨水平较模型组下降（P＜0.05）。模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠ALT水平分别为（355.4 ± 23.9）U/L、（327.6 ± 14.7）U/L、（237.3 ± 21.5）U/L、（237.3 ± 21.5）U/L，其中己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠血清ALT水平较模型组下降（P均＜0.05）。模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠AST水平分别为（520.0 ± 26.4）U/L、（486.7 ± 20.8）U/L、（385.3 ± 25.0）U/L、（371.2 ±26.4）U/L，其中己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠血清AST水平较模型组下降（P均＜0.05）。

2.3 各组大鼠脑水肿情况比较

2.3.1 各组大鼠血脑屏障通透性比较 对照组和模型组大鼠脑内EB含量分别为（0.75 ± 0.08）µg/g、（1.83 ± 0.28）µg/g，两组相比，P＜0.05。

模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠脑内EB含量分别为（1.83 ± 0.28）µg/g、（1.66 ± 0.23）µg/g、（1.48 ±0.32）µg/g、（0.97 ± 0.13）µg/g，其中己酮可可碱高剂量组大鼠脑内EB含量较模型组明显下降（P＜0.05）。

2.3.2 各组大鼠脑组织含水量检测 对照组与模型组大鼠脑组织含水量分别为76.0% ± 2.6%、85.0% ± 2.0%，两组相比，P＜0.05。

模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠脑组织含水量分别为85.0% ± 2.0%、84.1% ± 1.8%、83.4.% ± 2.1%、79.7% ± 1.2%，其中己酮可可碱高剂量组大鼠脑组织含水量较模型组下降（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠脑组织中AQP4 mRNA和蛋白相对表达量比较 对照组和模型组大鼠脑组织中AQP4 mRNA和蛋白的相对表达量分别为0.10 ±0.02、0.16 ± 0.03和0.20 ± 0.04、0.31 ± 0.05，两组相比，P均＜0.05。

模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠脑组织中AQP4 mRNA相对表达量分别为0.31 ± 0.05、0.30 ± 0.07、0.29 ± 0.03、0.18 ± 0.04，其中己酮可可碱高剂量组大鼠脑组织中AQP4 mRNA相对表达量较模型组下降显著（P＜0.05）。模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠脑组织中AQP4蛋白相对表达量分别为（0.20 ± 0.04）、（0.18 ± 0.05）、（0.16 ± 0.06）、（0.11 ± 0.03），其中己酮可可碱高剂量组大鼠脑组织中AQP4蛋白相对表达量较模型组下降显著（P＜0.05）。

2.5 各组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β水平比较 对照组和模型组大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β水平分别为（42.9 ± 6.4）pg/mL、（74.1 ± 5.6）pg/mL和（188.3 ± 20.1）pg/mL、（411.8 ± 22.0）pg/mL，两组相比，P均＜0.05。

模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠脑组织中TNF-α水平分别为（188.3 ± 20.1）pg/mL、（181.7 ± 17.0）pg/mL、（178.6 ± 18.3）pg/mL、（163.2 ± 11.4）pg/mL，其中己酮可可碱高剂量组大鼠脑组织中TNF-α水平较模型组下降（P＜0.05）。模型组、己酮可可碱低剂量组、己酮可可碱中剂量组、己酮可可碱高剂量组大鼠脑组织中IL-1β水平分别为（411.8 ± 22.0）pg/mL、（381.6 ± 17.6）pg/mL、（378.3 ± 18.1）pg/mL、（348.4 ± 19.8）pg/mL，其中己酮可可碱高剂量组大鼠脑组织中IL-1β水平较模型组下降（P＜0.05）。

3 讨论

己酮可可碱是一种非选择性磷酸二酯酶抑制剂，可抑制磷酸二酯酶减少细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水解为5'-磷酸腺苷，增加细胞内cAMP的水平，诱导细胞发生相应变化，抑制细胞的钙离子内流，具有扩血管、改善微循环、改善细胞缺氧、抗炎、抗氧化以及免疫调节等作用［11-12］。我们早前的研究已经证实，在急性肝损伤大鼠模型中，己酮可可碱可通过清除体内过多自由基及减轻脂质过氧化作用，减少肝细胞的损伤，改善肝组织的病理变化，从而对急性肝损伤的发生、发展起到一定的抑制作用［13］。在对肝性脑病的研究中证实，氨代谢障碍并不能独立解释肝性脑病的所有神经改变，肝性脑病患者的炎性标志物水平明显增加，抑制炎症反应，不仅可以延迟肝性脑病的发生，还能减轻其脑水肿的程度。近来的研究发现，己酮可可碱的抗炎、抗氧化作用还可以有效减轻脑缺血/再灌注损伤的脑水肿程度。而有关己酮可可碱是否对肝性脑病脑水肿具有作用，目前研究较少。

水通道蛋白在机体内分布的范围比较广泛，它们大多数选择性地分布在与体液吸收或分泌相关的细胞及可能协同跨细胞转运的内皮细胞中，执行着各部位水分的重吸收、液体分泌和细胞内外水平衡功能。AQP4是中枢神经系统最主要的水通道蛋白，对维持构成血脑屏障通透性及脑内水平衡至关重要［4］。脑水肿的形成与AQP4表达升高有着密切的关系，AQP4可能参与急性HE脑水肿的发生、发展过程。本研究通过建立急性肝性脑病模型，并给予不同剂量己酮可可碱干预治疗，结果显示模型组大鼠出现活动减少、精神萎靡、食欲不振，对外界刺激反应迟钝，体质量明显减轻，大鼠表现出肝性脑病的症状。进一步通过行为学测试发现，模型组大鼠明显出现探索活动减少、学习记忆能力下降及精神障碍等异常表现，而己酮可可碱高剂量组大鼠上述肝性脑病症状则得到明显改善。通过对各组大鼠血清学指标的检测发现，己酮可可碱高剂量组可有效降低急性肝性脑病大鼠血氨及血清中AST、ALT水平，高剂量己酮可可碱对大鼠的肝功能有显著改善作用。在对各组大鼠脑水肿情况的检测中发现，己酮可可碱高剂量组大鼠的脑组织中EB含量及脑组织含水量均较模型组下降，表明高剂量己酮可可碱在一定程度上可改善肝性脑病大鼠脑水肿情况，并通过降低血脑屏障的通透性以改善脑水肿程度；进一步通过PCR、Western blotting检测进一步发现，与模型组相比，己酮可可碱高剂量组AQP4 mRNA及蛋白相对表达量均显著下降。因此，我们推测高剂量己酮可可碱能有效减轻急性肝性脑病大鼠脑水肿情况，降低血脑屏障通透性，其机制可能与下调肝性脑病大鼠脑组织中AQP4的表达有关。

细胞因子是一组与免疫活化和炎症反应相关的可溶性多肽介质，正常情况下细胞因子不能通过血脑屏障，但在脑损伤时血脑屏障被破坏，使细胞因子透过被破坏的血脑屏障进入脑实质，同时细胞因子也可直接破坏血脑屏障，使其通透性增加，直接或间接作用于神经胶质细胞，诱发其分泌产生更多的细胞因子或使神经胶质细胞表面表达更多的细胞因子受体，从而释放各种神经毒性因子，如氧自由基，进一步破坏血脑屏障和损伤细胞膜，产生和加重血管源性及细胞毒性脑水肿［14-16］。而炎症因子IL-1β、TNF-a能介导星形胶质细胞AQP4表达上调和脑水肿的形成［17］。本研究结果显示，与模型组相比，己酮可可碱高剂量组能抑制TAA诱导的急性肝性脑病脑组织中TNF-α和IL-1β的水平，因此我们推测己酮可可碱可能通过降低肝性脑病脑组织中细胞炎症因子TNF-α和IL-1β的水平，抑制炎症反应，从而下调脑组织的AQP4表达，减轻脑水肿。

综上所述，200 mg/（kg·d）己酮可可碱灌胃能改善急性肝性脑病大鼠的脑水肿，其机制可能与下调脑组织中AQP4表达、降低TNF-α和IL-1β水平有关。这为肝性脑病脑水肿的临床治疗提供了新的思路，未来有待开展高质量的研究，以期进一步研究其具体的分子作用机制。