高吸附杂环胺乳酸菌的筛选、吸附特性及机理研究

王惠汀，刘培清，晓 燕，苏 琳，靳 烨，赵丽华*

（1 内蒙古农业大学 呼和浩特 010018 2 呼和浩特市抽样监测与重大活动保障中心 呼和浩特 010018 3 乌兰察布市市场监督管理局 内蒙古乌兰察布 012000）

杂环胺类化合物（Heterocyclic aromatic amines，HAAs）是富含蛋白质的食物在加工过程中产生的一类致癌、致突变性的物质。20 世纪70年代，人们首次在烤牛肉和烤鱼的表面发现了杂环胺，并发现长期摄入含HAAs 的食物会增加患结肠癌、乳腺癌、肝癌等癌症的风险[1]。目前，人类已发现近30 种HAAs[2]。研究表明，一些富含蛋白质的肉制品如腌腊肉制品、油炸肉制品、酱卤肉制品等经过高温加热后都被检出杂环胺[3]。随着生活水平的提高，人们对于食物的要求不再只是色、香、味，而更侧重于食物的安全品质。

研究发现，可以通过多种方式来抑制杂环胺的形成，例如：适当降低加热温度、缩短加热时间以及对原料肉进行微波预处理来减少加工肉制品中杂环胺的产生[4-6]；添加香辛料、黄酮类等抗氧化物质来抑制杂环胺的生成[7-8]。

虽然有大量的方法可以控制杂环胺的形成，减少食用者的摄入，但是仍有部分杂环胺进入体内，因此，对于杂环胺代谢的调控也是必不可少的。有研究表明，部分发酵乳制品中的乳酸菌可以吸附未代谢的HAAs，从而使其失活，不能再进行代谢，最后排出体外。Bolognani 等[9]确定了产乳酸生物体的活培养物对膳食致癌物的结合作用，并研究乳酸菌对苯并[a]芘、杂环胺（2-氨基-3-甲基咪唑[4，5-f]-喹啉（2-amino-3-methylimidazo[4，5-f]quinoline，IQ）、2-氨基-3，4-二甲基咪唑[4，5-f]-喹啉（2-amino-3，4-dimethylimidazo[4，5-f]quinoline，MeIQ）、2-氨基-3，8-二甲基咪唑[4，5-f]-喹喔啉（2-amino-3，8-dimethylimidazo[4，5-f]quinoxaline，MeIQx）、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶[4，3-b]吲哚（3-amino-1-methyl-5Hpyrido [4，3-b]indole，Trp-P-2）、PhIP）的结合能力，结果发现，长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌对苯并[a]芘和Trp-P-2 的结合最为有效，而对MelQx、MelQ、PhIP 和IQ 的结合能力较差，且乳酸菌对杂环胺的吸附能力与培养过程中的pH 值条件密切相关。目前，多数人认为其吸附机理是乳酸菌中细胞壁上的肽聚糖与HAAs 发生阳离子交换[10]。

本研究筛选对PhIP 具有高吸附能力的乳酸菌，研究其吸附特性及机理，以期减少肉制品中PhIP 的含量，为我国乳酸菌的综合开发和利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌（37X-6）、戊糖片球菌（37X-15）、弯曲乳杆菌（X3-1B）对PhIP 具备较高的吸附能力，均由内蒙古农业大学肉品科学与技术团队提供。菌种存于30%甘油冻存管中，于-80 ℃保存待用。

MRS 液体培养基：醋酸钠·3H2O 5 g、酵母提取粉5 g、柠檬酸氢二铵2 g、磷酸氢二钾2 g、大豆蛋白胨10 g、牛肉浸粉10 g、吐温80 1 mL、葡萄糖20 g、盐液A 5 mL、蒸馏水1 000 mL，pH 6.2～6.3，121 ℃灭菌15 min。

盐液A：MgSO4·7H2O 11.5 g、MnSO4·4H2O 2.8 g、蒸馏水1 000 mL。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260vwd 型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；DSH-300A 型回旋式水浴恒温振荡器；Centrifuge 5810R 型高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；SN510C 型立式压力蒸汽灭菌器，重庆雅马拓科技有限公司；电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；TESCAN MIRA4型扫描电子显微镜，泰思肯贸易（上海）有限公司；Thermo Scientific NICOLET iS20 型傅里叶红外光谱仪，赛默飞。

1.3 方法

1.3.1 供试菌株的制备 甘油保存的菌株解冻后，接种于5 mL MRS 液体培养基中，在培养箱中培养18～24 h，获得一代菌。之后按照2%接种量，将菌株活化三代。将活化好的三代菌液离心（4℃，6 000 r/min，5 min）弃上清，用超纯水洗涤菌体2 次（4 ℃，6 000 r/min，5 min）后调整细胞浓度为1×1010CFU/mL 用于后续试验。

1.3.2 菌株对PhIP 的吸附 将1.3.1 节中所得到的菌泥中加入1 mL 无菌超纯水，5 μL PhIP 标准工作液（50 mg/L），振荡匀混后，于37 ℃培养20 min 后，于4 ℃、12 000×g 下离心15 min，收集上清，过0.22 μm 有机滤器，用HPLC 测定上清液中PhIP 的含量。以不含菌株的PhIP 水溶液为空白对照。

菌体对PhIP 的吸附率按计算公式：

1.3.3 各因素对菌株吸附PhIP 的影响

1.3.3.1 吸附时间的影响 按1.3.1 节和1.3.2 节操作，将菌株调至pH 6，与PhIP（50 mg/L）于37℃培养，分别在0，0.3，1.5，24，48，72，96，120，144 h 取样，测定不同时间对菌株吸附PhIP 的影响。

1.3.3.2 吸附温度的影响 按1.3.1 节和1.3.2 节操作，将菌株调至pH 6，与PhIP（50 mg/L）分别于4，20，37，45 ℃培养1.5 h，测定不同温度对菌株吸附PhIP 的影响。

1.3.3.3 pH 值的影响 将1.3.1 节制得的菌株分别悬浮于0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液（pH 3，4，5，6）和Tris-HCl 缓冲液（pH 7，8，9）中，与PhIP（50 mg/L）于37 ℃培养1.5 h，测定不同pH 值对菌株吸附PhIP 的影响。以不含菌株的缓冲液与PhIP工作液混合作为空白对照。

1.3.3.4 菌体细胞浓度的影响 将菌株细胞浓度分别调整至1×106，1×107，1×108，1×109，1×1010CFU/mL，pH 值调至6，与PhIP（50 mg/L）于37 ℃培养1.5 h，测定不同菌体细胞浓度对菌株吸附PhIP 的影响。

1.3.4 不同处理方式对菌株吸附PhIP 的影响

1.3.4.1 热处理 将1.3.1 节制得的菌株于100℃下加热30 min，按操作1.3.2 节测定菌株对PhIP的吸附能力。以未经热处理的菌株作为对照。

1.3.4.2 酶处理 将1.3.1 节制得的菌株分别悬浮于10 mg/mL 中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶，40 ℃摇床（150×g）培养4 h，无菌水洗涤2 次，按操作1.3.2 节测定菌株对PhIP 的吸附能力。以未经酶处理的菌株作为对照。

1.3.5 乳酸菌吸附PhIP 前、后扫描电镜观察 将-80 ℃保存的乳酸菌接种于5 mL MRS 培养基中，37 ℃培养18～24 h，按2%接种量连续活化3 代，按照1.3.2 节测定菌株对PhIP 的吸附能力，取吸附前后的菌体沉淀悬浮于2.5%戊二醛，于4 ℃冰箱中固定过夜，4 ℃、6 000 r/min 离心5 min，弃上清。用0.1 mol/L PBS（pH 7.2）离心洗涤菌体3 次，每次10 min，然后用50%，70%，80%，90%，95%，100%的乙醇脱水，每次10 min，之后将菌体沉淀悬浮于乙酸异戊酯中，4 ℃冰箱中过夜，于冷冻干燥机中进行干燥处理。将干燥后的样品粘贴在铜台上，喷金后于扫描电镜下观察。

1.3.6 乳酸菌吸附PhIP 前后傅里叶红外光谱分析 将-80 ℃保存的乳酸菌接种于5 mL MRS 培养基中，37 ℃培养18～24 h，按2%接种量连续活化3 代，按照1.3.2 节测定菌株对PhIP 的吸附能力，取吸附前后的菌体沉淀，于-80 ℃冰箱中预冻24 h，于冷冻干燥机中进行干燥处理。称取2 mg 菌粉与200 mg 溴化钾粉末混合，研磨均匀后取适量粉末进行压片，成型后置于傅里叶红外光谱仪的检测台上，于4 000～400 cm-1波数范围内扫描。

1.4 数据处理

每组试验重复3 次，利用SPSS 26.0 进行单因素方差分析与显著性差异分析，数据结果以表示。图表利用Excel 软件进行绘制，差异显著，P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 具有高吸附PhIP 能力乳酸菌的筛选

本试验所用乳酸菌菌株主要分离自酸奶、酸菜汁、兰州大麦等发酵性食品，包括植物乳杆菌、戊糖片球菌等在内的3 个种共8 株菌。由表1 可以看出，乳酸菌菌种对PhIP 吸附能力没有菌株特异性，同一菌种内吸附率有高有低。所选8 株乳酸菌中，戊糖片球菌37X-15 具有较高的吸附率，为83.36%，植物乳杆菌CL4-3 吸附率最低，为7.93%。

表1 不同菌株的PhIP 吸附能力Table 1 Different strains on high PhIP adsorption capacity

2.2 各因素对菌株吸附能力的影响

2.2.1 时间对菌株吸附能力的影响 由图1 可知，3 株菌对PhIP 的吸附率变化趋势基本相同，均随吸附时间的增加，吸附率先升高后降低，而后趋于稳定。在0 h 时，菌株吸附率就已达到70%～80%，这是因为菌株对PhIP 的吸附可在较短的时间内完成，是一个快速的过程[11]。之后随着时间的延长，吸附率逐渐增加，菌株37X-15 在1.5 h 时吸附率达到最大，为85.82%，之后吸附率开始下降，直到96 h 之后趋于平稳，与144 h 无显著性差异；37X-6 和X3-1B 于24 h 时吸附率达到最大，分别为82.55%和77.00%，其中37X-6 于96 h 开始趋于平衡，X3-1B 于120 h 开始趋于平衡。吸附率趋于稳定的原因可能是表面结合位点饱和并达到了平衡[12]。

图1 吸附时间对菌株吸附PhIP 的影响Fig.1 Effect of adsorption time on PhIP adsorption by strains

2.2.2 温度对菌株吸附能力的影响 由图2 可知，菌株37X-15 和X3-1B 随温度的上升，吸附率先增加然后逐渐下降，且于37 ℃吸附率达到最大值，分别为83.51%和73.00%，而菌株37X-6 于37 ℃逐渐趋于平衡，变化幅度较小，这与解琳等[13]研究结果一致。菌株会在适宜的温度下生长，不同的温度对其生长及活力影响不一，同时菌株对PhIP 的吸附能力也会受到温度的影响。这可能是因为温度影响了细胞壁酶的活性，导致菌体吸附率受到影响[14]。由此可知，菌株吸附PhIP 的最适温度为37 ℃。

图2 温度对菌株吸附PhIP 的影响Fig.2 Effect of temperatures on PhIP adsorption by strains

2.2.3 pH 值对菌株吸附能力的影响 由图3 可知，3 株菌在pH 值的影响下吸附率呈现出相同的变化趋势，均随pH 值的升高先增加后减少，当pH值为6 时，3 株菌的吸附率均达到最大值，其中37X-15 的吸附率最高，为83.12%，37X-6 次之，为80.85%，X3-1B 吸附率最小，为74.35%。当pH值大于6 时，菌株吸附率显著降低，最终在pH 值为8 时达到平衡。研究发现，乳酸菌对致癌因子的吸附重要因素之一就是pH 值，不同的pH 值对致癌物质吸附效果影响不一，这可能是因为pH 值会影响细胞壁上一些吸附基团如氨基、巯基、磷酸盐等，从而影响吸附平衡时间和吸附能力[15]。

图3 pH 值对菌株吸附PhIP 的影响Fig.3 Effect of pH on PhIP adsorption by strains

2.2.4 菌体浓度对菌株吸附能力的影响 由图4可知，3 株菌随菌株浓度的增加吸附率变化趋势相同，均随菌株浓度的增加吸附率先增加而后趋于平衡，菌株37X-15 和X3-1B 于109CFU/mL 开始趋于平衡，而菌株37X-6 对PhIP 还会有缓慢增加，但增加不显著。3 株菌吸附率均于1010CFU/mL达到最大值，且菌株37X-15 吸附率最大，37X-6次之，X3-1B 最小，吸附率分别为84.33%，83.54%，71.23%。吸附率趋于稳定或缓慢增加的

2.3 不同处理方式对菌株吸附PhIP 的影响

2.3.1 热处理对菌株吸附PhIP 的影响 为了确定菌株细胞活性是否会对吸附作用有影响，对3株菌进行热灭活处理。由表2 可以看出，3 株菌经热灭活处理后，热处理之后菌株的吸附率较未处理菌株的吸附能力有所增加，说明菌株对PhIP 的吸附作用与其活力无关，并非是由于菌株生理代谢所引起的。Sreekumar 等[16]研究发现，菌体吸附PhIP 后形成的物质稳定性较低，是一种物理性吸附。热处理之后菌体吸附率增加的原因可能是热处理使蛋白质变性，从而使肽聚糖层交联减少，暴露出了更多的结合位点，进而对菌株吸附PhIP 效果发生变化[18]。

表2 菌体活力对菌株吸附PhIP 的影响Table 2 Effect of bacteria vitality on PhIP adsorption by strains

2.3.2 酶处理对菌株吸附PhIP 的影响 由图5原因可能是菌体对致癌物质的吸附能力是有限的，当吸附率达到一定程度后，菌体表面部位的吸附位点达到平衡，吸附率将不再增加[16]。这与李佳祺[17]研究结果一致。可知，菌株经酶处理后对PhIP 吸附率均有所提高，不同蛋白酶处理对菌株产生了不同的影响，其中菌株37X-15 经碱性蛋白酶处理后，吸附率增加较显著，达到89.26%；菌株37X-6 经胃蛋白酶处理后吸附率由80.43%增加到86.67%；菌株X3-1B 经中性蛋白酶处理后吸附率由70.96%增加到76.07%。菌株吸附率增加的原因可能是菌体经蛋白酶处理后，使细胞壁上的蛋白质脱落，暴露了更多的吸附位点[19]。而蛋白酶对菌株的作用较为温和，因此3 株菌的吸附率均未发生显著变化。

图5 酶处理对菌株吸附PhIP 的影响Fig.5 Effect of enzyme treatment on PhIP adsorption by strains

2.4 菌株吸附PhIP 前后扫描电镜观察

综上所述，菌株37X-15 对PhIP 有较好的吸附能力，为了进一步研究其吸附机理，本研究通过SEM 观察吸附前后菌体表面的微观形态变化，从而判断PhIP 对菌体细胞结构的影响。

图6 为菌株吸附PhIP 前后的扫描电镜图，其中A 为菌株吸附前的电镜观察图，从图中可以看出，菌株在吸附前，细胞形态完整、菌体表面光滑，呈现出较为规则的圆形。B 为菌株吸附后的SEM图，可以看出菌株在吸附PhIP 后，细胞表面遭到了严重的破坏，细胞形态变化极其明显，菌体细胞出现凹陷扁塌。这可能是因为PhIP 进入细胞后取代了大量维持细胞平衡的阳离子，导致细胞面临了不利于生长的环境，不能良好生长，从而发生变形甚至破裂[20]。

图6 菌株吸附PhIP 前后扫描电镜图Fig.6 Scanning electron micrographs of strains before and after PhIP adsorption

2.5 菌株吸附PhIP 前后傅里叶红外光谱分析

为了进一步探究菌株37X-15 在吸附PhIP 前后细胞壁上化学基团变化情况，利用傅里叶红外光谱仪对菌株37X-15 吸附PhIP 前后进行了检测。

由图7 可以看出，菌株37X-15 吸附PhIP 前后谱图出现明显差异，吸附后的谱图较吸附之前的谱图部分基团波数有所变化，峰位发生位移，主要体现在微生物分析灵敏区1 000～2 000 cm-1。说明菌株37X-15 吸附PhIP 后菌体细胞结构受到了明显损伤。3 400～3 200 cm-1处宽而强的吸收峰为缔合O-H 伸缩振动峰和N-H 的伸缩振动峰共同作用形成，图中原位于3 388.87 cm-1处伸缩振动峰移至3 309.30 cm-1，这种变化表明可能是细胞壁上的-OH 和N-H 参与了吸附；2 970～2 840 cm-1为CH3（甲基）、CH2（亚甲基）和CH（次甲基）中C-H 键的伸缩振动峰，图中位于2 932.85 cm-1的C-H 伸缩振动峰位移至 2 932.24 cm-1，说明甲基、亚甲基、次甲基等基团参与吸附导致峰位移动；1 680～1 630 cm-1处的峰为酰胺I 带，是由酰胺基（-CONH2）中的 C=O 引起的伸缩振动，1 653.36 cm-1处的峰移动到了1 653.66 cm-1处，说明蛋白质酰胺Ⅰ带中的C=O 键通过伸缩振动参与了PhIP 的吸收与富集，但是位移不明显，可以认为C-O 键的功能性官能团没有参与；1 541 cm-1处的吸收峰为酰胺Ⅱ带，是N-H 弯曲振动和C-N 伸缩振动；1 232 cm-1处为酰胺Ⅲ带，主要是C-N 伸缩振动和N-H 弯曲振动，酰胺峰I 和酰胺峰Ⅱ为蛋白质的特征吸收峰，酰胺峰Ⅲ仅有参考作用；1 065 cm-1对应多糖类C-O 和P=O 的存在[21]。

图7 菌株吸附PhIP 前后的红外光谱图Fig.7 Infrared spectra of strains before and after PhIP adsorption

综合以上结果，菌株吸附PhIP 的主要部位在细胞壁上，细胞壁上各种官能团的活性直接影响菌株的吸附。参与PhIP 吸附的基团有细胞壁上蛋白质酰胺Ⅱ带、胺基中的C-N、O-H、N-H、C-O、P=O 基团、细胞壁上的多糖成分，同时细胞膜上的甲基、亚甲基、次甲基等基团也参与了吸附过程。

3 结论

本试验主要研究了乳酸菌对PhIP 的吸附特性及机理。结果发现菌株37X-6、37X-15 及X3-1B 对PhIP 有较好的吸附效果，且当菌株细胞浓度为1010CFU/mL、pH 值为6、温度37 ℃、吸附时间为1.5 h 时，菌株的吸附效果最好。经蛋白酶和热处理后，菌株对PhIP 的吸附率无显著影响（P＞0.05）。以具有PhIP 高吸附性菌株37X-15 为研究目标，对其机理进行研究。通过扫描电镜及傅里叶红外光谱结果分析得知，菌株吸附PhIP 后，细胞表面遭到了严重破坏，细胞出现凹陷扁塌；菌株吸附PhIP 的主要部位在细胞壁上，参与PhIP 吸附的基团有细胞壁上蛋白质酰胺Ⅱ带、胺基中的CN、O-H、N-H、C-O、P=O 基团、细胞壁上的多糖成分，同时细胞膜上的甲基、亚甲基、次甲基等基团也参与了吸附过程。为乳酸菌进一步的合理开发利用提供了参考依据。