肠道菌群与异基因造血干细胞移植研究进展

傅 鑫,黄晓兵,2△

异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)是治疗各种恶性肿瘤,特别是造血恶性肿瘤最有效的治疗手段。然而,由于其危及生命的并发症,如移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)、感染和复发,allo-HSCT的应用受到限制。目前越来越多的研究表明,肠道菌群组成及多样性与allo-HSCT后患者临床结果密切相关。抗生素的合理选择,益生元、益生菌、后生元和粪菌移植等靶向肠道菌群的干预措施可减少allo-HSCT后并发症,改善患者预后。因此,笔者对allo-HSCT后肠道菌群与GVHD、感染、复发和免疫重建之间的关系做一综述,并且讨论了针对肠道菌群的多种治疗手段,为临床上改善allo-HSCT预后提供策略。

1 肠道菌群与宿主免疫

肠道上皮由肠上皮细胞、杯状细胞、Paneth细胞、M细胞等细胞组成。肠上皮细胞及其之间紧密连接是肠道屏障关键组成部分。肠道中杯状细胞产生的黏液层将肠道共生体与上皮分离,为肠道提供保护屏障。肠道Paneth细胞通过分泌抗菌蛋白抑制细菌入侵。M细胞负责调节粘膜免疫及肠腔抗原的捕获[1]。此外,以短链脂肪酸为代表的微生物代谢产物也可调控肠道上皮的内稳态,肠上皮内稳态同时促进微生物在肠道中的定殖,当内稳态打破时肠道菌群将失调[2]。在allo-HSCT受体中,由于其潜在的恶性肿瘤、全身放射治疗以及暴露于抗生素和化疗药物,降低了肠道屏障的完整性,而具有非常高的感染和炎症并发症风险。肠道细菌及其组成部分(病原体相关分子模式)转移到固有层并被抗原提呈细胞识别,激活效应细胞和加重GVHD。GVHD导致的B细胞、Paneth细胞和粘膜层的破坏加剧肠道炎症和细菌易位,导致allo-HSCT后的生存率下降。

2 肠道菌群对移植结果及移植相关疾病的作用

2.1 肠道菌群与GVHD

2.1.1肠道微生物与GVHD GVHD是allo-HSCT后移植相关并发症中最主要、最严重的一种。肠道菌群失调与GVHD之间互为因果、恶性循环。针对allo-HSCT后微生物群作用的早期研究并未报道特定的肠道微生物种类与GVHD或移植相关死亡率的相关性。随着基因测序技术的进步,越来越多的证据表明allo-HSCT受体肠道菌群多样性及特定的组成与移植预后相关。动物实验表明,在GVHD小鼠肠道中梭菌丰度明显降低,重新引入梭状芽孢杆菌分离株的混合物可以产生高水平的丁酸从而上调Treg细胞、增加肠道完整性,延长GVHD小鼠存活时间[3]。allo-HSCT后患者临床数据显示,患者粪便中较高的肠球菌科及葡萄球菌科丰度与急性GVHD的风险增加相关[4]。相比之下,属于梭菌纲的Blautia属丰度增加与GVHD相关死亡率降低和总体生存率提高显著相关[5]。最近Burgos等[6]发现,胃肠道急性移植物抗宿主病(GI-aGVHD)患者发病前后的粪便样本中可以检测到菌群失调,且GVHD发病前粪便中梭菌纲成员丰度降低、产丁酸菌减少、严格厌氧菌/兼性厌氧菌比值降低与allo-HCT后更短的生存期和较高的GVHD相关死亡风险有关。由此可见,针对肠道微生物组的分析或可预测GVHD的发病率和严重程度,从而有可能进行早期针对微生物组的干预。

2.1.2微生物代谢物和GVHD 微生物代谢产物由肠道菌群产生的多种中间产物和终产物组成,在调节肠道稳态和免疫应答中发挥着至关重要的作用[7]。据报道, 接受allo-HSCT患者微生物代谢产物短链脂肪酸、芳香烃受体配体、多胺等水平发生了显著变化,尤其是在急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)患者中。短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)是微生物发酵膳食纤维的主要产物,参与调节宿主肠道稳态和能量代谢[8]。动物实验表明,allo-HSCT后发生GVHD小鼠肠道内短链脂肪酸丁酸浓度明显降低,通过直接服用丁酸或通过改变微生物组增加产丁酸菌恢复丁酸水平可以减轻GVHD严重程度并提生存率[3]。在GVHD患者中, SCFAs浓度(包括乙酸、丙酸和丁酸)均明显降低并与GVHD严重程度和死亡率相关,其中丁酸浓度在GVHD各阶段均显著降低,可作为GVHD诊断标志物[9]。近期Meedt等也证实了allo-HSCT患者肠道菌群产丁酸能力与患者GVHD严重程度、GVHD相关死亡率及移植相关死亡率呈显著负相关[10]。

芳香烃受体(AhR)配体是来源于肠道菌群代谢,对维持肠上皮屏障,调节先天及适应性免疫至关重要[11]。在GVHD小鼠模型中,给予AhR配体吲哚衍生物可以改善GVHD严重程度,降低GVHD相关死亡率,同时保持移植物抗白血病效应(GVL)[12]。Michonneau等[13]发现,GVHD患者AhR配体水平显著降低,包括3-吲哚醇硫酸酯(3-IS)、吲哚乙酸、吲哚乙酰谷氨酰胺和吲哚丙酸。Weber等[14]发现,低水平尿液3-IS与较高的移植相关死亡率和较低的总生存率相关,可能是预测GVHD的潜在生物标志物。此外,Wu等[15]发现微生物代谢物氧化三甲胺 (TMAO) 或高胆碱饮食可通过NLRP3依赖的机制诱导M1巨噬细胞极化进而增强Th1和Th17分化,增加小鼠GVHD严重程度和死亡率,提示我们通过对allo-HSCT患者控制胆碱饮食可能是减轻GVHD的有效策略。综上,微生物代谢物在GVHD的发生过程中发挥重要作用,可能是预防和治疗GVHD的靶点,然而其具体作用机制仍不清楚,需要进一步研究阐明。

2.2 肠道菌群与感染感染是allo-HSCT后非复发死亡的主要原因之一,仅次于GVHD。在allo-HSCT患者中,术前放疗、化疗及抗生素治疗导致肠道菌群失衡、肠道微生物单一优势,显著增加菌血症风险。Taur等[16]发现在近50%的患者在发生菌血症之前已存在相应菌群在肠道内占优势,这些患者中菌群肠道优势与菌血症之间的中位时间为7天,肠道中肠球菌支配的患者发生耐万古霉素肠球菌菌血症风险增加9倍,肠变形菌支配的患者发生革兰氏阴性杆菌菌血症风险增加5倍。Harris等[17]研究了肠道菌群在allo-HSCT后肺部并发症中的作用,发现γ-变形菌属肠道优势是allo-HSCT后肺部并发症(包括感染)的重要预测因子。Haak等[18]发现allo-HSCT后患者粪便中产丁酸菌丰度较高的患者其发生呼吸道病毒感染风险比其它患者低5倍。因此,通过监测肠道微生物变化可以预测患者发生感染的风险,并且针对肠道微生物群的保护对预防感染可能有一定帮助。

2.3 肠道菌群与复发目前普遍认为肠道共生菌在肿瘤免疫监测中发挥重要作用。有假说提出了抗原拟态,认为微生物蛋白与肿瘤相关抗原具有密切的相似性。也有研究者认为肠道共生菌通过非特异性激活先天免疫细胞发挥肿瘤免疫检测。最近研究发现肠道微生物组特定成员与降低allo-HSCT后复发风险有关。Peled等[19]通过对541例allo-HSCT患者肠道微生物的丰度与疾病复发/进展之间的回顾性研究发现,粘液真杆菌丰度较高与疾病复发/进展的风险降低相关,在有和无这组细菌的患者中,2年的复发/进展累积发生率分别为19.8%和33.8%。这可能与粘液真杆菌产生丰富的短链脂肪酸增强了allo-HSCT后GVT效应有关。有研究者在此基础上提出了在allo-HSCT后,通过接种粘液真杆菌来改变疾病复发率高风险患者的肠道菌群以降低复发率的可能性。此外,肠道中咽峡炎链球菌丰度较高的患者移植后复发率较低,而屎肠球菌与复发风险增加相关[20]。这些可能成为潜在诊断或治疗靶点,全面了解肠道菌群驱动黏膜和全身免疫调节的机制,可能有助于在改善GVT效应的同时缓解GVHD,提高allo-HSCT后的总体生存率。

2.4 肠道菌群与免疫重建Allo-HSCT后免疫重建与感染、肿瘤复发密切相关,而肠道菌群在移植后免疫重建中可能发挥重要作用。研究表明,肠道微生物群的存在可促进小鼠骨髓生成并降低其感染敏感性[21],抗生素处理的小鼠表现出对骨髓中所有祖细胞亚型造血的多系抑制[22]。一项对无菌小鼠与野生小鼠免疫系统研究[23]表明,无菌小鼠在肠道黏膜中的效应T细胞少于野生小鼠,通过将无菌小鼠与野生型小鼠混养后可以促进无菌小鼠免疫系统成熟。Staffas等[24]发现在骨髓移植小鼠模型中,用抗生素清除肠道菌群可损害移植后的免疫重建,主要表现在抑制淋巴细胞和嗜中性粒细胞的分化和恢复。Ingham等[25]在对allo-HSCT后儿童的肠道、口腔和鼻腔菌群动态监测中发现CD4+T、Th17和B细胞的重建与三个部位的菌群具有相关性,其中肠道中毛螺菌科、瘤胃球菌科和乳杆菌科菌群高丰度与CD4+T细胞、TH17细胞亚群这些适应性免疫细胞群数量呈正相关。这表明肠道微生物群在塑造免疫系统中发挥着重要作用,并可以作为提高移植后免疫的一种靶向策略。目前移植后免疫重建的评估包括检测绝对淋巴细胞计数,淋巴细胞亚群和抗体滴度以及功能分析和TCR多样性,然而将免疫重建与微生物组学相结合的临床研究较少,未来的前瞻性研究需要整合这些领域的研究,以更好地探究微生物组在allo-HSCT后免疫重建中的潜作用。并且,目前针对肠道菌群与免疫重建的研究只阐明了相关性,转化应用仍在起步阶段,其背后的机制需要我们进一步深入研究。

3 针对肠道菌群改善allo-HSCT结果的策略

3.1 抗生素肠道菌群多样性与allo-HSCT后总生存率相关,这个发现使研究者提出了关于allo-HSCT受体细菌净化的问题,即如何在不影响治疗疗效的情况下保持“健康”共生微生物对机体的保护作用。抗生素治疗类型可能决定肠道菌群组成和菌群破坏程度。一项对allo-HSCT患者及小鼠的回顾性研究[26]发现某些能破坏肠道微生物组的广谱抗生素会增加GVHD相关死亡率,并且具有厌氧活性的抗生素与较高的GVHD相关死亡率有关。Weber 等[27]发现利福昔明单独使用或配合全身抗生素治疗可以改善肠道GVHD的症状和降低移植相关死亡率。Hayase等[28]提出,碳青霉烯类抗生素可以促使拟杆菌破坏黏液层而加重GVHD。除抗生素类型外,抗生素治疗时间也会影响微生物多样性并可能影响患者的预后。一项多中心回顾性研究[29]表明,早期接触抗生素导致梭状芽孢杆菌显著减少并增加GVHD相关死亡率。近期一项动物实验[30]表明,长期抗生素暴露可以引起淋巴细胞功能障碍和共生细菌全身逃逸导致感染风险增加。综上所述,抗生素是一把双刃剑,在发挥抗感染效果的同时会影响肠道微生态而加重GVHD、延缓免疫重建,因此需慎重评估抗生素的作用。在allo-HSCT受者中抗生素早期降阶治疗并限制使用广谱抗生素及消除专性厌氧菌的抗生素可能有助于改善患者预后。当然,这需要进行多中心前瞻性研究来评估抗生素的选择对allo-HSCT后中性粒细胞减少期间细菌感染的短期风险,以及抗生素使用所致的微生物组多样性改变对长期终点(移植物抗宿主病、免疫重建和微生物耐药性)的影响,以优化allo-HSCT受体中抗生素的使用,在防止菌血症同时减少肠道菌群损伤对长期预后的影响。

3.2 益生元益生元是指一种不易消化的化合物,通过在肠道中被微生物代谢,能调节肠道菌群的组成和/或活性,以对宿主提供有益的生理作用。益生元对机体的有益影响已在各种研究中得到证实。近期Holmes 等[31]发现,低聚半乳糖(GOS)通过影响肠道菌群可在一定程度上提高GVHD小鼠的生存率和缓解GVHD症状。Hayase 等[28]提出口服补充木糖可防止经美罗培南治疗的小鼠的结肠黏液层变薄而改善其GVHD生存率。这些研究为在造血干细胞移植中研究益生元提供了一个令人信服的理论基础,益生元可能成为预防GVHD的一种辅助疗法。

3.3 益生菌益生菌是用于改善健康的活体微生物,具有调节免疫功能、生成有机酸和抗微生物产物、与宿主及其菌群互作、改善肠道屏障、产生酶和具有系统性影响的小分子等作用。在小鼠GVHD模型中已经证明通过梭菌治疗可以改善GVHD[3]。近期的一项研究[32]揭示了新一代益生菌嗜粘蛋白-阿克曼氏菌(AKK菌)在加速肠上皮再生、促进IEC发育、促进肠道屏障完整性、抑制炎症反应等方面发挥重要重要,这为将益生菌应用于辅助治疗GVHD提供了理论基础。同时,大多数患者在在allo-HSCT后几周内出现肠道细菌多样性下降且多达一半的菌血症发生在肠道细菌占主导地位之前,这表明给予益生菌预防病原体定植的潜在有效性。然而目前针对益生菌在在allo-HSCT受者中的应用较少,仅限于临床前模型和小型试点试验,缺乏大规模循证医学依据。值得注意的是,也有报道益生菌的使用可能产生负面作用。免疫功能低下的自体干细胞移植的套细胞淋巴瘤患者在过度食用富含嗜酸乳杆菌的酸奶后发生嗜酸乳杆菌败血症[33],提示益生菌在特定人群中的潜在安全性问题。近年来,基因工程技术的出现可以使益生菌分泌具有有益作用的化合物,如抗菌肽(AMPs)。不少研究报道了基因工程改造的益生菌在强化肿瘤免疫治疗、治疗肠道耐药菌及艰难梭菌感染中的作用。相信在不久的将来,益生菌可能会通过基因工程技术为allo-HSCT宿主带来福音。

3.4 后生元后生元是对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂。菌群分泌、修饰或降解的小分子可调控宿主健康,基于这些代谢物的疗法称为后生元疗法,这种方法与益生菌策略和粪便移植相比具有更高的安全性和可操作性。有多项研究探讨了后生元对肠道疾病改善的效果。在一项小鼠结肠炎模型中[34],口服灭活的Akk菌或是Akk菌的外膜蛋白Amuc_1100(一种后生元),可以通过调节CD8+细胞毒性T细胞和巨噬细胞改善结肠炎。特别是在GVHD小鼠模型中[3],通过增加肠道中吲哚或其衍生物的水平可以显著降低了小鼠GVHD的风险。一项针对5例复发性艰难梭菌感染患者的研究[35]表明,从供者粪便中转移无菌滤液而不是粪便微生物群,足以改善艰难梭菌感染症状。这提示我们后生元疗法与益生菌疗法、粪菌移植相比,细菌成分、代谢物可能是一种替代方法,特别是对于免疫功能低下的患者。这研些究给后生元应用于allo-HSCT患者来改善肠道完整性并预防肠道移植物抗宿主病带来了启发。然而目前将后生元应用于造血干细胞移植患者的临床资料还很少,且菌群代谢物具有多重功能且大多数代谢物功能尚不清楚,围绕这些我们还需要更为深入的研究。

3.5 粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)FMT作为恢复肠道菌群的一种临床手段,早期用于治疗复发性艰难梭菌感染。近年来,有大量临床研究在探索FMT用于治疗血液肿瘤患者的艰难梭菌感染、类固醇难治性急性GVHD和多重耐药细菌感染。在一项针对FMT在激素难治性或激素依赖性肠道GVHD患者小规模研究[36]中,所有患者均通过FMT改善了GVHD症状且未发现由于FMT造成的不良反应。Bilinski 等[37]研究发现,急性GVHD患者对FMT的总应答率及完全应答率分别可达到57%及42%,而在慢性GVHD患者中,FMT可维持或改善器官受累情况。Spindelboeck等[38]证实了FMT可缓解肠道移植物抗宿主病,延长总生存期。此外,Ghani 等[39]提出,FMT可显著降低多药耐药菌定殖患者血流感染,并显著减少碳青霉烯抗生素的使用、抗生素使用时长、菌血症和住院时长。当然, 也有FMT后感染并发症的病例报道,1例allo-HSCT患者在接受FMT后引起产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌菌血症而导致死亡[40]。然而目前尚缺少FMT应用于造血干细胞移植患者的大规模临床研究,我们需要进行长期随访和更大规模的研究来评估FMT对allo-HSCT患者的安全性和有效性。

4 未来与展望

识别具有诊断意义和预后意义的微生物标志物对于告知患者风险和选择合适的治疗策略至关重要,然而关于肠道微生物组在造血干细胞移植受者中的作用,以及如何利用微生物组预防或治疗移植相关疾病,仍有许多悬而未决的问题。肠道微生物群和造血干细胞移植领域中的许多研究实际上只证明了相关性,从相关性转向因果性仍然是一个重要且必要的步骤。未来的研究将进一步剖析肠道菌群如何调宿主生理活动以改善患者健康和预后。