单细胞分析技术在炎症和衰老领域中的研究进展

侯雪冬 ，李锡勇 ，董文文，白骏恒，韩鹏飞

1.长治医学院研究生处，山西长治 046000；2.长治医学院附属和平医院乳腺科，山西长治 046000；3.长治医学院附属和平医院骨科，山西长治 046000

近年来，人口老龄化领域的研究取得了一些进展，尤其在细胞衰老和炎症方面。Baar MP等[1]和Baker DJ等[2]的研究发现清除衰老细胞可以明显改善实验小鼠的健康状态和生存活力。而与此同时，单细胞测序（分析）技术应运而生，鉴于不同类型的细胞发生炎症和衰老的模式或途径不同，因此，将单细胞测序技术与细胞衰老和炎症领域研究二者相融合会更加有理论依据和应用前景。

衰老及衰老相关的炎症研究热点更多着眼于该生物学事件的全过程，而目前单细胞测序更多的是横向组学研究，即所有转录组学数据都是单一细胞水平的横断面数据。除Schüssler-Fiorenza RoseSM等[3]少数已使用批量转录组学进行单细胞测序外，仍然缺乏与衰老过程相关的单细胞水平纵向多组学研究。而鉴于在个体层面上，原则上可以从同一个体反复提取血液或组织样本，因此，未来纵向多组学研究是可行的。另外，目前单细胞测序标本是基于不同时间点的不同物种来源的差异性个体，涉及到与衰老全过程相关的RNA转录表达变化缺乏时间轴上序列观察（监测），且Bahar R等[4]和Martinez-Jimenez CP等[5]研究发现随着年龄的增加细胞转录异质性也随之增大，因此纵向多组学研究也是必要的。

在大多数情况下，单细胞测序是基于预先公布的特定标记基因来定义细胞类型的。目前，人们普遍认为细胞衰老并不意味着细胞类型的改变，而是与年龄相关的特定细胞类型的状态变化，尤其是生物学功能方面的退化，即细胞衰老的研究，聚焦在与细胞衰老相关标记基因的表达变化。例如，某种类型的细胞可处于“早期”或“晚期”以及“部分”或“完全”状态。此外，结合细胞结局（死亡、发病和/或功能障碍）和组学数据可以选定预测衰老相关结局的生物标志物。

1 细胞衰老与炎症

最早关于细胞衰老的研究是Hayflick L等[6]1961开展的，其研究结果发现人类二倍体成纤维细胞在培养过程中具有有限的复制潜能，随后细胞进入不可逆的复制停滞状态。而Harley CB等[7]认为这种细胞分裂的复制性衰老现象与端粒DNA的不断丢失有关。由于DNA聚合酶具有5´->3´方向性，复制机制不能复制线性染色体的末端，因此，随着时间的推移，DNA的丢失最终会触发细胞周期检查点，阻止细胞进一步分裂。这种复制性衰老，也被Röhme D[8]称为海弗利克极限，存在于许多物种中，并认为其与最长寿命相关，并由Harley CB等[7]总结为衰老的端粒理论。

然而，近年来，除端粒磨损作为诱导细胞衰老的机制之外，Campisi J[9]和 Coppé JP 等[10]还发现各种类型的应激，包括活性氧、辐射、DNA损伤剂和未折叠蛋白反应都参与了细胞衰老的诱导过程[9-10]。因此，McHugh D等[11]认为细胞衰老是细胞的一种特殊应激反应状态，伴随着广泛的细胞形态和生化改变。另外，衰老细胞经常分泌细胞因子、生长因子和基质金属蛋白酶的炎症混合物，形成所谓的衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）。这种旁分泌信号进而产生组织重塑、慢性炎症甚至肿瘤发生等一系列负面影响。

衰老细胞是复制停滞但存在分泌表型、应激反应和代谢改变的一些细胞。用于鉴定细胞衰老的关键标志物是β-半乳糖苷酶 和p16（CDKN2A）或p21（CDKN1A），后者在大多数衰老细胞中表达。

2 单细胞测序

2009年首次实现单细胞的全转录组测序，此后，单细胞测序技术发展迅速，从仅对人工挑选的单个细胞进行测序，发展到对数十万个细胞进行大规模多重测序，目前，单细胞测序已经成为一种成熟且可获得的技术，涉及单个细胞的整个基因组、转录组或表观基因组等多个领域。此外，随着测序协议的出现，单细胞测序数据分析方法也迅速兴起。目前可用于单细胞测序数据分析的工具资源已多达630多种。虽然在某些情况下，一套预定义的工具和参数可以提高单细胞测序的分析速度和数据的可重复性。然而，由于分析工具和计算方法的数量庞大，单细胞测序分析仍处于快速发展中。值得庆幸的是，单细胞测序工作流程的每个步骤均已进行了基准研究，因此，可根据项目需求选择性使用。

3 细胞衰老的单细胞分析

3.1 多组织研究

Tabula Muris Consortium[12]在小鼠体内进行多组织研究，选取了6个时间点的18个组织，1~30月，报告了约53万个基因表达。值得注意的是，在老年小鼠中，表达衰老标记物p16（CDKN2A）的细胞比例增加了一倍。Zhang W等[13]随后对这些数据进行了分析，指出包括 Ubq、App、Ctnnb1、Mapk1、Rac1、Arf1和Junb等在内的20个“衰老基因”，其表达在超过50%的细胞类型中随年龄增加而显著变化，故认为其与细胞衰老有关。其中Ubq是唯一具有良好特征的基因，这表明蛋白质稳态在小鼠衰老中发挥重要作用。另外，在信号转导通路水平上，mTOR通路被发现显著下调，这与衰老细胞转录下调的总体趋势相匹配。

而Kimmel JC等[14]研究，分析了幼龄（7月龄）和老龄（21月龄）小鼠的约55 000个单细胞，分别来自肺、肾和脾脏。研究发现，与年龄相关的基因表达变化在很大程度上是细胞类型特异性的，而较少依赖于组织类型。此外，也发现了大约200个基因在5种以上的细胞类型中有不同水平的表达。这些基因优先参与蛋白质运输到内质网及炎症发生过程。

3.2 单组织研究

相关学者研究数据显示，与年轻小鼠相比，研究了10个衰老相关基因，这些基因在更多老年小鼠细胞中表达，尤其是在肝脏的库普弗细胞中。而Franceschi C等[15]的研究则发现几乎100%的库普弗细胞中都存在于老年小鼠中，但在年轻小鼠的这些细胞中仅有37%出现。库普弗细胞是常驻肝脏的巨噬细胞，衰老的库普弗细胞吞噬和自噬能力降低，并表现出促进炎症的炎症表型增加。尤其是白细胞介素-1b（interleukin 1b, IL-1b），它是一种参与炎症的细胞因子，也是衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）的组成部分。此外，Elyahu Y等[16]发现在酒精性脂肪性肝炎的情况下，IL-1b与肝脏炎症和细胞衰老有关。

3.2.1 血液和动脉 由于血液标本易于获取，故首先被应用于单细胞测序研究中。相关学者通过研究幼龄（3月龄）和老龄（21月龄）小鼠在接受体外免疫刺激前后1 500个幼稚CD4+T细胞的转录模式发现，与幼龄小鼠相比，老龄小鼠参与免疫激活过程的基因对刺激有较低幅度反应，且表现出更大的细胞间转录变异性，这提示免疫衰老。而Elyahu Y等[16]在研究了幼龄和老龄小鼠中约24 000个CD4+T细胞的转录组后，报告了免疫衰老特征性的幼稚CD4+细胞的减少。细胞毒性、耗竭和活化的调节性T细胞由于其可表达炎性细胞因子（主要是IL-27、IFNb和IL-6），故被认为可能反映了老龄小鼠的炎症特征，而这3种CD4+亚型在幼龄动物中却很少观察到。

Grover A等[17]在一项与年龄相关转录特征的研究时，通过对幼龄（2~3月龄）和老龄（20~25月龄）小鼠的造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSC）进行对比分析，发现特定的“老”星状细胞亚群的积累，血小板谱系基因表达上调的同时，还伴随着与年龄相关的红细胞和淋巴样细胞减少的现象。但是，当关键血小板编程因子FOG-1受损时，HSC生成淋巴样细胞能力却可以得到恢复。

Elyada E等[18]在单细胞水平上研究了幼龄（6岁）和老龄（20岁）食蟹猴主动脉和冠状动脉的差异。他们检测了近8 000个内皮细胞，平均每个细胞识别出了3 100个基因，其中有515个基因表达下调，259个基因表达上调，并且通过生物信息学分析，发现FOXO3A是动脉老化的关键调控因子。

3.2.2 胰腺 研究显示，细胞衰老与胰腺导管腺癌（pancreatic duct adenocarcinoma, PDAC）和糖尿病（1型和2型）的发展和治疗有关。相关学者在研究胰腺衰老标志物时发现，与年轻供体相比，在老年供体胰腺细胞中存在更高比例的p16（CDKN2A），并推测衰老胰腺中衰老细胞的比例增加，但由于细胞外基质存在，可能会阻止旁分泌作用，因此衰老细胞周围的正常细胞不会受到影响。

Elyada E等[18]对PDAC中涉及的癌症相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts, CAFs）进行了详细研究，认为CAFs通过修饰胶原交联、分泌多种细胞因子（诸如趋化因子和生长因子）以及招募免疫抑制细胞来促进肿瘤生长，而Özdemir BC等[19]和Rhim AD等[20]研究显示CAFs实际上限制了肿瘤的生长。Elyada E等[18]在另一项对人类和小鼠胰腺细胞进行的单细胞研究中，表明CAFs实际上是由不同亚型组成的异质细胞群，例如肌成纤维细胞CAF（myCAF）、炎症性CAF（iCAF）和抗原呈递CAF（ap⁃CAF）。其中，iCAF与炎症和细胞衰老密切相关，其表达的白细胞介素和细胞因子也具有SASP特征。

为了研究胰岛衰老细胞如何参与人类和非肥胖糖尿病（non-obese diabetic, NOD）小鼠模型的1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）的发展，Thompson PJ等[21]对8、14和16周龄NOD小鼠的21 000个细胞进行了单细胞scRNA-seq测序。他们发现β细胞成熟标记物Ucn3在该簇中被发现耗尽，且通过去除抗衰老化合物（BCL-2抑制剂）可以防止NOD小鼠出现T1D，这表明免疫系统在T1D的情况下无法清除衰老细胞，因此认为衰老可作为T1D的一种治疗措施。

3.2.3 大脑 Ximerakis M等[22]在对幼龄和老龄小鼠的脑组织大约50 000个细胞的单细胞转录组学进行了研究，通过差异基因表达分析发现，在许多细胞类型中，选定的转录基因组的表达变异系数在年轻细胞和衰老细胞之间存在差异，但是在大多数脑细胞类型中，衰老和衰老相关的通路上调的同时，核糖体蛋白的转录似乎也都是上调的。

而Kiss T等[23]研究描述了老龄小鼠大脑微血管内皮细胞功能失调，可以导致血管性认知障碍和阿尔茨海默病等疾病。他们通过离心、过滤和分离从小鼠中提取和消化的脑组织，选定表达模式和预先编制的衰老标志物列表（如CDKN2A和Bmi1）聚类鉴定衰老的脑微血管内皮细胞，发现约10%脑微血管内皮细胞和小胶质细胞发生细胞衰老（相当于75岁人类的生物学改变）。

小胶质细胞，即大脑中的巨噬细胞，根据体外刺激方法，它们被分为静息型、M1促炎型和M2抗炎型。Hammond TR等[24]进行了小鼠脑小胶质细胞从胚胎发育到老龄的单细胞转录组学研究。他们发现，小胶质细胞亚群在衰老过程中异质性增加。一些衰老的小胶质细胞表达Ccl4趋化因子且被认为与炎症相关。

3.2.4 肺脏 Angelidis I等[25]对幼龄（3月龄）和老龄（24月龄）动物的约15 000个肺细胞进行了测序，并确定了30种不同的细胞类型。通过单细胞scRNA-seq与蛋白组学相结合，试图在基因转录组和蛋白质组水平上发现折叠变化之间的显著相关性，如Ⅳ型胶原mRNA水平呈年龄相关性下降，但蛋白水平却呈年龄相关性上升趋势。

正如Enge M等[26]通过富集分析发现某些细胞类型中胆固醇的生物合成增加一样，他们观察到慢性炎症，并且认为气道上皮细胞的相对频率改变是肺衰老的标志，并进一步推测脂质稳态的失调和上皮细胞衰老有关。而Reyfman PA等[27]基于对不同年龄的8名健康供体和8例肺纤维化患者的约76 000个单细胞进行分析，发现在源自纤维化肺组织的肺泡Ⅱ型干细胞群体中，复制性衰老的1 311基因特征得分最高。

3.2.5 皮肤 Solé-Boldo L等[28]从男性供体受阳光保护的腹股沟皮肤区域收集15 000多个皮肤细胞，并在样本中发现了14种已知细胞类型，其中，他们根据聚类（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding,t-SNE）图和GO术语富集分析识别出4种成纤维细胞亚型（包括分泌性乳头状成纤维细胞、分泌性网状成纤维细胞、间充质成纤维细胞和促炎成纤维细胞）。此外，他们比较了年轻与老年捐赠者的样本，以研究年龄依赖性变化，揭示成纤维细胞具有一组特定亚型的“皮肤衰老相关分泌蛋白”（skin-aging associated secreted proteins, SAASP），这与之相关学者的研究结果保持一致。但值得注意的是，研究皮肤衰老过程必须特别小心，因为人类暴露在阳光下的“光老化”会强烈影响衰老相关过程，这成为研究的主要混杂因素。

3.2.6 肌肉 Hernando-Herraez I等[29]在使用来自幼龄（2月龄）和老龄（25月龄）小鼠的377个单肌肉干细胞同时，根据标记Pax7对细胞进行分类，并检测相同细胞中的转录组和DNA甲基化。他们发现在幼龄小鼠和老龄小鼠的转录组和蛋白质组水平的异质性增加。在单细胞水平上，启动子区域的甲基化程度与基因表达之间呈负相关。

3.3 体外研究

Tang H等人报道的衰老细胞体外研究，通过培养HCA2成纤维细胞直至复制性衰老，并对来自早期、中期和晚期传代的总共1200个细胞进行单细胞转录组学和端粒侵蚀研究[30]。他们还对早期传代细胞进行辐射应激以诱导细胞过早衰老（Stress in⁃duced premature senescence, SIPS）并分析了其中的400个细胞。通过t-SNE的可视化分析不同传代的细胞，发现晚期传代衰老细胞比辐射应激诱导的衰老细胞异质性更高，并进一步证实，细胞衰老不仅在不同的细胞类型中存在差异，而且还取决于引起衰老状态的应激源。

Aarts M等[31]采用文库干预方法与单细胞测序相结合的方法，基于人类原代成纤维细胞（IMR90）表达的重编程因子，以利识别出最适合抑制细胞衰老的shRNA。他们锁定得分最高的4个靶基因分别为p21、MTOR、MYOT和UBE2E1，并认为后两者可作为肌节部分和E2泛素结合酶新的候选基因。而Banito A等[32]也报道了转录因子诱导的重编程应激可降低iPSC生成的效率并进一步导致细胞衰老。

综上所述，细胞衰老标志物表达频率和总量的增加，以及转录异质性增加（通常是由DNA双链断裂等损伤引起的），这些是单细胞研究揭示最常见的细胞衰老模式，伴随着单细胞测序技术的不断进步，将为未来衰老方面的研究提供更广阔的应用前景和理论贡献。