不同产地待宰生猪的非洲猪瘟病毒检测

钟 东，宁广南，牟礼乾*，王永妮，梁雄燕，宋运福

（1.广西玉林市福绵镇水产畜牧兽医站，广西 玉林 537023；2.广西玉林市沙田镇水产畜牧兽医站，广西 玉林 537034；3.广西玉林市福绵区动物疫病预防控制中心，广西 玉林 537023；4.广西玉林市仁厚镇农业农村综合服务中心，广西 玉林 537012；5.广西玉林市成均镇水产畜牧兽医站，广西 玉林 537024）

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起猪的一种高致病性、高死亡率、急性传染性疾病，世界动物卫生组织（OIE）将ASF 列为法定报告动物疫病，该病也是各国重点防范的一类动物疫情。2018 年8 月辽宁省沈阳市出现国内首例非洲猪瘟疫情，随后蔓延至国内各地，2019 年5 月广西玉林市博白县发生非洲猪瘟疫情［1］。为有效阻断ASF 疫情蔓延，广西壮族自治区农业农村厅相继下发文件，要求生猪定点屠宰企业（厂、场）建设非洲猪瘟PCR 检测实验室，并对产地生猪及生猪产品采取“点对点”调运备案管理。屠宰企业是生猪调运的终点站，对不同产地待宰生猪进行采样检测有着重要意义，可有效检验不同产地生猪养殖场（户）对非洲猪瘟病毒防控是否到位，官方兽医产地检疫是否严谨等。本研究对玉林市福绵区某屠宰企业不同产地的待宰生猪采集全血样本进行荧光PCR检测。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 冰箱，可调移液器及吸头，1.5 mL离心管，防护用品，高速台式离心机，荧光PCR仪及配套反应管等。

1.2 主要试剂 非洲猪瘟病毒荧光PCR 检测试剂盒，包含：阴性对照、阳性对照、样品稀释液、荧光PCR反应液。

1.3 样品采集 非洲猪瘟病毒样品可从猪肉、猪血管、淋巴结、脾脏等部位采集。本次检测主要使用生猪全血作为样本，为提高检测效率。同一来源地的生猪最多100头为1份混合血样［2］，使用无菌注射器抽取200 μL 生猪全血样本至1.5 mL无菌离心管中，待检。

样本采集后应及时检测，未能及时检测的需保存于-20 ℃冰箱中，样本保存期间应避免交叉污染。

1.4 检测方法

1.4.1 试剂准备 实验前30 min 从冰箱中取出试剂盒（试剂盒保存条件为-20 ℃），待恢复至室内温度（15～25 ℃）使试剂完全融化［3］。按照单反应体系配制方法，将试剂分装至PCR 反应管中，拧紧反应管盖子，其余试剂返回冰箱-20 ℃冷冻保存。

1.4.2 样本准备 DNA 提取：为避免DNA 酶受到污染并保护操作者，进行下述操作时必须佩戴一次性手套和口罩。

（1）待检样品份数要求为n份，则取n个无菌的1.5 mL离心管，并对离心管编号。

（2）离心管中加入样品稀释液80 μL。

（3）离心管中分别加入已处理的待检样品20 μL，充分混匀，室温下放置2 min。

（4）离心机设置5 000 r/min 离心1 min，取上清20 μL 即为待检DNA 模板。提取好的DNA 模板如不能立即检测的，建议放冰箱中-20 ℃以下保存。

1.4.3 加样 打开装有PCR 反应液的反应管分别向其中加入已提取的样本模板（标记：A1、A2、A3），阳性对照（标记：C2），阴性对照（标记：C1）各2.5 μL，在记录本上记录加样顺序。

将所有的反应管振荡混匀后以2 000 r/min离心10 s，随即转到PCR扩增步骤。

1.4.4 PCR 扩增 启用荧光PCR 仪预热并检验仪器性能。将准备好的PCR 反应管放置于荧光PCR仪样品槽，并记录放置顺序。设置荧光PCR 仪参数进行扩增。参数设置为：50 ℃孵育2 min；95 ℃预变性2 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 个循环；在每一循环的60 ℃时收集FAM通道采集荧光信号。

2 结果判定

详见表1。

表1 Ct值结果判定

3 检测结果

按上述操作流程，从2022 年3 月1 日至3 月10日开展实验检测，每日对生猪采集全血样本并作荧光PCR 检测，检测样本数为3 份（样本标记：A1、A2、A3），累计采集750 头生猪全血样本。结果显示：生猪全血样本无Ct值，判定均为阴性，详细检测数据见表2。

表2 PCR检测生猪全血样本Ct值

4 结论

PCR 检测结果表明，在当地严格的防控要求下，不同产地的生猪均未检出非洲猪瘟阳性，证明非洲猪瘟疫情防控措施取得了积极效果。生猪养殖在产地、运输车辆、运输路径、屠宰销售等环节形成了健全的、可追溯的长效机制，最大限度地降低了非洲猪瘟疫情对经济社会造成的不利影响。但受限于实验室设备及人手不足等因素，检测的样本较为单一，仅使用了生猪全血作为PCR检测样本，下一步将增加生猪样本采集部位，以进一步论证不同产地生猪养猪场（户）等在贯彻落实当地非洲猪瘟防控策略中的实际效果。