饮用水的微生物污染研究现状

许景成，徐知明，张玉娟

（深圳市通量检测科技有限公司，广东深圳 518102）

随着人们物质生活水平的日益提升和媒体对食品安全问题的频频曝光，消费者对食品安全越来越关注，而饮用水安全作为食品安全的重要组成部分，应引起相关部门的重视。根据世界卫生组织的一项调查，饮用水与全球80%的疾病有关，每年约有1.2 亿人因饮用水污染和卫生条件恶劣而患病。此外，饮用水污染会导致霍乱、腹泻、甲型肝炎、伤寒和小儿麻痹症等传染性疾病的爆发。我国仍有2.8 亿人使用受污染的饮用水[1]。水源水从净化到使用的过程时间长，极易受到微生物的污染，易导致感染性肠道疾病。

1 饮用水的微生物污染研究现状

致病性微生物污染问题是目前食品行业最大的食品安全问题。在我国，多数食品中毒由致病性微生物引起。近年来，各食品生产企业的调查研究显示食品微生物污染的源头首先指向饮用水[2]。国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会联合颁布的《生活饮用水卫生标准》（GB 5749 —2022）基于我国近些年的饮用水监测、检测和调查数据，在国内外关于污染物健康效应最新研究成果的基础上，采用了健康风险评估的技术方法，同时考虑了我国的实际情况和管理要求，修订了饮用水的监测指标和限量值，水质指标数量从106 项调整到97 项，其中常规指标43 项、扩展指标54 项，微生物指标增至6 项，增加了大肠埃希氏菌、耐热大肠菌群、贾第鞭毛虫和隐孢子虫指标，要求不得检出总大肠菌群和大肠埃希氏菌，菌落总数不得超过100 CFU·mL-1[3]。

饮用水的质量安全问题一直是国内外关注的焦点。当前饮用水的质量主要与化学风险和微生物风险有关，化学风险主要包括一些重金属（如砷、铬、氟、铅）、硝酸根离子、总可溶性固形物和一些有机污染物。世界卫生组织制定的《饮用水水质准则》中指出，与化学风险相比，微生物风险是饮用水安全的主要问题，应该作为关注重点[4]。然而国内对饮用水的检测多聚焦于矿物质元素含量、农药残留、消毒副产物残留和有机物含量等的检测，对于饮用水中微生物的检测技术与方法的研究略有缺乏。

2 致病微生物的危害

饮用水污染常见的致病微生物有铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、嗜肺军团菌和分枝杆菌等。其中铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌以及霍乱弧菌为饮用水常测指标。

2.1 铜绿假单胞菌的危害

铜绿假单胞菌可通过水源、土壤、器皿和接触等方式传播，是水质污染的指示菌，对化学试剂的抵抗力比普通革兰氏阴性菌强，具有多重耐药特征，感染率较高。铜绿假单胞菌含有多种毒力因子，主要包括多种外毒素（绿脓素、黏附素和肉毒素等）和内毒素等致病因子，该菌可以感染多种身体组织或器官，如皮肤和软组织、血液系统和呼吸系统。铜绿假单胞菌是一种食源性致病细菌，可引起急性肠道疾病和皮肤炎症[5]。

2.2 肠道病原体的危害

在水源中传播的病原体中，肠道病原体（如大肠杆菌、沙门氏菌和霍乱弧菌）是最常见的病原体，人类常通过摄入受污染的水和食物而感染。据报道，致病性大肠杆菌在地下水源中的流行比在地表水源中更加广泛；霍乱弧菌在地表和地下水源中均存在，这些肠道细菌是各种疾病及其并发症的病原体。

大肠杆菌产生的内毒素、黏附素以及肠毒素等均可能导致腹泻，感染严重者可能伴有溶血尿毒综合征，有致命的危险，其危害较大，可用于监测饮用水源和再生加工用水水质。沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，是全球细菌性胃肠炎的主要病因之一。沙门氏菌的致病性是大量毒力相关因子相互作用的结果，主要有毒力岛毒力因子、质粒毒力因子、结构性毒力因子（包括菌毛和鞭毛）、肠毒素毒力因子等[6]。霍乱弧菌是革兰氏阴性菌，其对营养的要求不高，但对环境因素比较敏感，如对热、干燥、日光和常用消毒剂等较为敏感[7]。产毒素霍乱弧菌现被认为是许多水体环境中低等植物区系原来存在的成员，可长期存活并繁殖而不失去毒力决定簇。研究表明，在霍乱流行期间，水生环境可能是霍乱弧菌的来源，霍乱弧菌可产生肠毒素，人们摄入含有霍乱弧菌的饮用水后，可引起霍乱的暴发[8]。

3 饮用水中一般微生物的常见检测

细菌数量的增加是生物安全风险上升的明显标志，可以用特定细菌、细菌群或总细菌群落的变化来衡量。特异性检测传统上是在选择性培养基上进行培养。传统培养法是基于对纯培养物的分离，并通过对分离物的形态、代谢和生化特征进行鉴定，或通过显微镜检查等更简单的染色反应来鉴定具有某种特性的细菌。传统方法有滤膜法、多管发酵法、酶底物法、免疫磁分离荧光抗体法。随着分子生物学技术的发展，荧光技术与流式细胞术、高通量测序等方法也逐渐被应用到微生物的检测中。

3.1 传统检测技术

3.1.1 滤膜法和多管发酵法

滤膜法适用于杂质含量较少的饮用水检验，操作简单，但检验准确率相对较低。多管发酵法适用于不同类型饮用水样本的检验，该方法主要采用最大可能数法对微生物检验情况进行表示，有利于监测总大肠菌群密度情况，以及对水质安全性进行评定。多管发酵法对饮用水中某些微生物（如大肠杆菌、杂菌与耐热大肠菌群）的检出率比滤膜法更高，但多管发酵法的操作步骤复杂、检测时间长[9]。

3.1.2 酶底物法

酶底物法常用于检测大肠埃希氏菌，在选择性培养基中以β-半乳糖苷酶诱导细菌释放色原体，使培养基呈现颜色变化，再用分光光度计测得的OD值变化检测水中的总大肠菌落。

3.1.3 免疫磁分离荧光抗体法

免疫磁分离荧光抗体法适用于饮用水中贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊（简称“两虫”）的测定。由于“两虫”的体积小，耐氯性强，且在水环境中孢囊和卵囊的存活期和潜伏期均较长，常规方法无法将其灭活，导致其存在水平较高。因此，常采用Filta-Max 法过滤、淘洗、浓缩、免疫磁珠分离、免疫荧光分析和微分干涉镜检等技术进行分析和检测，具有过滤速度快，回收率高且稳定的特点，但成本费用较高，操作步骤烦琐，加上“两虫”的传染性高，需要研究人员熟练操作。

3.2 新发展技术

传统培养方法可检测出的微生物数量仅占总数的0.1%，大部分微生物无法依靠培养的方式获得。传统培养法具有操作烦琐、耗时长等弊端。因此，为更加深入地了解饮用水中的微生物群落结构并探究不同群落间的相互作用，必须依靠更加先进的分子生物学工具。在培养、血清学和分子方法等诊断技术中，分子方法诊断速度最快，且具有高灵敏度、特异性和安全性。

3.2.1 荧光技术与流式细胞术

基于荧光染色的流式细胞术是流式细胞术根据荧光测量快速表征和定量不同的菌群，通过检测特定波长范围的通道测量荧光强度，可快速针对悬浮于液相环境中的单个细菌或微球进行多参数定性和定量分析，以实现细菌的绝对计数与不可培养计数。该技术现已被广泛应用于微生物学研究中，如对微生物污染的水进行细菌的快速计数、联合使用荧光染色的特异性配体鉴别目标细菌、通过制备配体功能化微球建立多重检测方法等。

3.2.2 高通量测序

高通量测序技术可分析复杂细菌群落。应用该技术可实现一次并行并对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定，从而对样品进行分类学鉴定，并提供有关微生物群落结构的详细定性和定量信息。该方法也可用于研究饮用水中的细菌多样性和丰度，以观察微生物群落变化、检测致病菌、观察生物膜的形成与变化等。该法灵敏度较高，是对传统测序技术的一次革命性变革[10]。

3.2.3 PCR 技术

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是检测各种样品中多种微生物的最广泛使用的分子方法之一。水是传播沙门氏菌、霍乱弧菌和大肠杆菌等致病菌的来源之一，PCR 技术因其快速、特异、灵敏、需样品量少等优势被广泛应用于检测和鉴别水中的沙门氏菌、霍乱弧菌和大肠杆菌等。

4 饮用水中VBNC 状态细菌的检测

饮用水中的细菌可在消毒等因素诱导下进入活的不可培养（Viable But Non-Culture，VBNC）状态。VBNC 状态的细菌可在适当的条件下复苏，对饮用水安全造成危害。例如，当外界环境不利于生长时，霍乱弧菌会进入VBNC 状态，此时霍乱弧菌无法在培养基上进行细胞分裂而生长，但其代谢活动仍在继续，并且仍可以致病[11]。

普通的直接活菌计数法无法检测到VBNC 状态的细菌，导致测得细菌总数偏低。使用抗生素作用于VBNC 细菌，由于其具有的抗生素耐受性，使其伸长，可在显微镜下筛选读数，但此方法存在特异性、灵敏度较低等缺点。目前，常用单叠氮丙啶-荧光定量PCR、反转录荧光定量PCR 与应用最大或然数联用、流式细胞仪技术和适宜的细胞活性染料、5-氰基-2,3-二聚氯四唑联合流式细胞术和D2O 标记拉曼光谱联用等技术测定不同活性状态下的细菌数量和浓度[12-13]。

5 结语

我国饮用水微生物污染问题仍然存在，亟待解决。相关部门应重视并加强监督监测，结合我国的水源水质风险、水质净化和水质检验技术水平、污染物健康效应等制定饮用水水源标准，强化源头管控要求，提高饮用水卫生保障水平，保障食品安全。