SDE-GC-MS结合OPLS-DA分析不同生态区谷子品种香气特征

李少辉，赵巍，刘松雁，李朋亮，张爱霞，刘敬科

SDE-GC-MS结合OPLS-DA分析不同生态区谷子品种香气特征

1河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所，石家庄 050051；2石家庄市畜产品和兽药饲料质量检测中心，石家庄 050041

【背景】我国谷子产地分为4个地区，包括东北平原地区、华北平原地区、内蒙古高原地区和西北地区，谷子区域试验旨在筛选具有良好遗传性状的种质资源。但是，良好的生长遗传性状和米粒外观表型未必具有良好的烹饪品质和香气特征，特别是香气特征在很大程度上影响了其生产和下游产业。蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）是一种预处理手段，可模拟煮粥的过程，适合于谷子的香气分析。【目的】明确不同生态区谷子种质资源香气特征，推动感官导向型育种-加工产业实践。【方法】采用同时蒸馏萃取-气相色谱-质谱联用法（simultaneous distillation extraction-gas chromatography-mass spectrometry,SDE-GC-MS）结合香气活性值法（odor activity value，OAV），分析我国华北、东北、西北和内蒙古4个生态区谷物香气成分差异。【结果】SDE-GC-MS分析结果表明4个生态区12个谷子品种共检测出81种挥发性物质，包括醛类25种，醇类6种，酚类4种，酮类11种，碳氢11种，含苯衍生物13种，酸类4种，其他7种。对比检测结果发现，不同地区中挥发性物质的种类基本相似，但各成分相对含量有所不同。对37种挥发性成分特征进行了香气描述，并结合香气活性值确定了12个谷子品种有23个OAV>1的有贡献的香气化合物。通过正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）建立谷子区试的有效判别模型，将12个谷子品种划分为3类，筛选出18种VIP（variable importance in projection）大于1的化合物：2,4-癸二烯醛、()-3,5-辛二烯-2-酮、2-(2-丙烯基)-呋喃、己醛、2-戊基呋喃、2-乙酰基噻唑、庚醛、()-2,4-癸二烯醛、3,5-辛二烯-2-酮、()-3-壬烯-2-酮、苯甲醛、十四酸、2-戊基呋喃、()-2-庚烯醛、庚醇、2-甲氧基-苯酚、乙基苯、十六酸甲酯，可用于区分不同样品之间的差异。【结论】SDE-GC-MS结合OAV鉴定分析了我国不同生态区谷子风味成分及关键香气特征化合物，OPLS-DA模型筛选了区分不同样品及生态区谷子风味差异的18种VIP化合物，研究结果为了解我国不同地区种植谷子风味特征的差异，以及以此为基础开展风味导向型谷子品种选育与种植加工提供了数据参考。

同时蒸馏萃取；谷子；香气活性值；生态区；正交偏最小二乘判别

0 引言

【研究意义】谷子（L. Beauv）为我国特色农作物，食用部分称小米，营养丰富[1]。我国谷子产地分为东北平原区、华北平原区、内蒙古高原区和西北地区4个地区。但谷子属于光敏作物，种质资源地理来源差异会对谷子造成异地不能抽穗、不成熟等现象，极大影响了谷子的生产与产业发展。鉴于谷子的生长特性，在区域试验时将谷子异地种植，以观察筛选遗传性状好的种质资源，筛选食用风味品质更好的品种。【前人研究进展】良好的生长遗传性状及小米外观表型未必有好的蒸煮品质和香气特征，尤其是香气特征，它是人们判断小米是否被接受及喜爱的关键点之一[2]。目前，食品中香气风味特征的鉴定手段主要有同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）[3]、固相微萃取[4]（solid-phase microextraction，SPME）、溶剂辅助蒸发萃取[5]（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）等前处理手段，提取风味物质，再通过气质联用技术或气质嗅闻进行鉴定，应用范围包括驼奶、鱼糜制品、蘑菇、薯片[6-9]等多种食品，并取得了良好的检测效果。SDE是样品与一定比例的溶剂在密闭烧瓶内持续沸腾，并通过另一端收集馏分的前处理手段，这一过程类似煮粥过程，且试验系统密闭，样品香气流失较少，适合对谷子样品进行分析。刘莹莹[10]采用SDE法结合GC-MS对不同产地谷子多种挥发性成分风味进行了鉴定，并将其分为醛、酚、酸、含苯衍生物、醇、酮、碳氢化合物和杂环化合物等8类。李明哲等[11]对不同颜色的谷子挥发性成分做了比较，并鉴定出了己醛、壬醛、（）-2,4-癸二烯醛和2-戊基呋喃等差异成分，指出这些可能是造成它们香气不同的原因。【本研究切入点】目前缺少我国不同生态产区谷子育种适应性风味特征的系统研究。【拟解决的关键问题】本研究根据样品的特性，选用同时蒸馏萃取模拟煮粥过程以更好地进行谷子风味萃取，在4个区试地区中各选3个品种共12个品种的谷子进行气相色谱风味成分检测，并通过气味活性值法（OAV）鉴定香气特征，利用判别产品产地的经典方法—正交偏最小二乘法判别分析对区试品种进行分类建模，为丰富我国谷子种质资源信息，探明谷子风味特征，推动我国以风味导向型育种生产为基础的谷子产业发展提供理论数据。

1 材料与方法

试验于2022年在河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所和石家庄市畜产品和兽药饲料质量检测中心实验室进行。

1.1 材料与试剂

由河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所通过国家谷子高粱产业体系平台提供12个谷子区试品种，从4个区中每个区选取3个优良品种，试验前置于-20℃备用，试验于2022年3—6月进行。NaCl，国药集团化学试剂有限公司；C7—C30烷烃标样，美国Sigma公司；乙醚（色谱纯），美国Honeywell公司；无水Na2SO4，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SY2001-NSART100碾米机：韩国双龙机械产业株式会社，SY88-TH砻谷机：韩国双龙机械产业株式会社；IKA MF10粉碎机：德国IKA集团，电子调温电热套：天津市泰斯特仪器有限公司，恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司，HP-5016GD氮吹仪：上海济成分析仪器有限公司；同时蒸馏萃取装置：南京銮玉化玻仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 同时蒸馏萃取（SDE） 同时蒸馏萃取方法参考刘莹莹[10]，略有调整。将150 g脱壳谷子和3 000 mL重蒸水加入5 000 mL的圆底烧瓶中，连接到SDE的右端置于电热套使溶液沸腾，在左端烧瓶中加入50 mL重蒸乙醚，水浴使乙醚也处于沸腾状态。将2 h内提取的乙醚置于冰箱冷冻过夜，加入无水硫酸钠除水相后氮气吹扫至1 mL，从中取1 μL进行GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS条件 检测方法参考LI等[12]，略有调整。GC检测条件：色谱柱为DB-5ms毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃。程序升温设置：起始温度45 ℃保留2 min，以2.5 ℃∙min-1的速率升温至65 ℃，并且保留2 min，然后再以5 ℃∙min-1升温到220 ℃，温度保留3 min。载气为氦气（He），流速1.0 mL∙min-1，不分流。

质谱检测条件：电离方式为EI，灯丝发射电流为200 μA，电子能量70 eV，接口温度为250 ℃，离子源温度为230 ℃，扫描质量范围33—450 amu。

1.3.3 数据处理 定性分析：通过NIST05谱库的检索保留正反匹配度在800（最大1 000）以上的物质，所得结果参考化合物保留指数的文献报道（retention index literature，RIL），对化合物进行定性分析。

定量分析：采用内标法对醋的香气成分进行定量，内标3-辛醇，加入量为50 mg∙L-1。化合物浓度=（化合物峰面积/内标峰面积）×内标浓度。

OAV=风味成分的浓度/此成分的阈值。

1.4 数据处理

每个样品重复检测3次，最终结果用平均值±标准差表示。采用SIMCA 13软件进行OPLS-DA分析，采用Origin 2018软件进行雷达图和热图绘制，热图由物质含量数据经过归一化后生成。

2 结果

2.1 4个生态区谷子挥发性风味整体情况

通过SDE-GC-MS技术分析4个生态区12个谷子样品挥发性风味组分，结果见图1。12个谷子样品共检测到81种，其中醛类25种，醇类10种，酮类11种，碳氢11种，含苯衍生物13种，酸类4种，杂环及其他7种，含量较高的挥发性风味成分有己醛、庚醛、苯甲醛、壬醛、2,4-癸二烯醛、4-乙烯基愈创木酚、2,4-二(1,1-二甲基)苯酚、法尼基丙酮、十五酸、十六酸、2-戊基呋喃。其中西北地区朝谷58、太选15、承11-727三个品种分别检测到51、46、55种，内蒙古地区1k196、1322-5、1323-20分别检测到60、47、53种，华北地区冀谷19、郑10-1、济0621-6分别检测47、52、49种，东北地区九谷、龙11-58070、双2008-5三个品种分别检测到43、41、46种。总含量最高的是太选15，含量达12 539.9 μg∙kg-1，其次是龙11-58070（9010.13 μg∙kg-1）和双2008-5（7 586.6 μg∙kg-1）。挥发性种类最多的是1k196，达到60种。

2.2 谷子挥发性成分分类结果

醛类是谷子中含量和种类均最多的一类物质[13]，也是最重要的一类物质，这与前人对谷子挥发性成分的研究结果相似。在醛类化合物中，庚醛、()-2-庚烯醛、苯甲醛未在冀谷19、郑10-1、九谷、龙11-58070、双2008-5中检测到，太选、济0621-6、龙11-58070的10个碳以上的长链醛类含量较少。总体来看，华北、东北两地区种植品种醛类物质较少，可能与气候和生长周期有关。

图1 不同地区谷子风味化合物含量热图

本研究检测发现6种醇类。醇类是谷子的重要挥发性成分，它们一般具有果香、花香和青草香[14]，除3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳三烯-3-醇外，绝大多数样品醇含量较低，一般在100 μg∙kg-1以下。1-己醇、1-辛烯-3-醇、1-辛醇存在于大多数谷子样品中，而苯乙醇仅在朝谷58中被检测到，含量仅为7.52 μg∙kg-1。

共检测到4种酚类化合物，分别为2-甲氧基-苯酚、4-乙烯基愈创木酚、2,4-二(1,1-二甲基)苯酚和2,5-二(1,1-二甲基)苯酚。2,5-二(1,1-二甲基)苯酚在大多数的样品中均被检测到，4-乙烯基愈创木酚仅在冀谷19和济0621-6中检测到。由于它们含有苯环，一般将其列为含苯衍生物类，但考虑到其生物活性[15]，将其单独列出来分析。

共检测发现11种酮类。酮一般在谷物中呈皂香味和果香味，样品中各类酮的浓度保持在5.3—240.09 μg∙kg-1。谷物常见的酮类2-庚酮、()-3,5-辛二烯-2-酮、()-3-壬烯-2-酮和香叶基丙酮在各品种小米含量最普遍，均被检测到。

另外，还检测到11种碳氢化合物、13种苯衍生物、4种酸、4种杂环类和1种酯类，这些物质和以上种类的物质共同构成谷子中挥发性成分。

2.3 谷子特征香气化合物及OAV分析结果

雷达图将12种谷子中有气味描述的37种化合物按照醛类、醇类、酮类、苯衍生物、其他共分为5类，分别在双2008-5、冀谷19、朝谷58、1k196、1322-5这几个品种中有较大香气贡献（图2）。

为了评价各物质的贡献，引入香气活度值（OAV）[16]，通过计算OAV得出区试谷子香气特征组分，表1为其香气阈值、风味描述和OAVs。12个谷子品种共有香气特征化合物37种。其中OAV>1的化合物有23种，己醛、庚醛、辛醛、苯乙醛、()-2-辛烯醛、壬醛、2-壬烯醛、癸醛、萘、(,)-2, 4-壬二烯醛、(,)-2, 4-癸二烯醛、2-戊基呋喃在所有谷子品种中均大于1，其余15种化合物部分OAV>1。各品种OAV>1的化合物数量有所不同，其中醛类最多，为9—14种，醇、酚类、酮类、苯的衍生物、其他化合物一般1—2种。而OAV<1，则对谷子的香气贡献不明显。

图2 不同区试谷子品种风味雷达图

2.4 不同区试谷子品种风味特征OPLS-DA

为了分析4组谷子样品之间的差异，基于相关性分析结果，对所得数据进行正交偏最小二乘分析以有效地说明样品之间的差异。该模型的R2X、R2Y和Q2得分分别为98.2%、100%和56.3%，提取的两个主成分可解释98.2%，表明OPLS-DA模型的数据拟合良好。考虑到监督分类模型容易出现过拟合，进行了200次排列检验来验证其准确性。如图3-A所示，得到的OPLS-DA得分图显示了3个不同的聚类，华北地区的郑10-16、济0621-6、冀谷19，西北地区的承11-727、太选15和朝谷58等6个谷子品种位于第一象限；内蒙古地区的1322-5、lk196和1323-20三个品种位于第二、三象限交界的X负半轴；东北地区的龙11-58070、九谷、双2008-5位于第四象限。由载荷图可知，2,4-癸二烯醛、十六酸等在第一主成分的载荷较大，己醛、庚醛、4-乙烯基愈创木酚、()-9,12-十八二烯酸等在第二主成分的载荷较大（图3-B）。

表1 不同生态区地区谷子挥发性气味化合物香气活性值

续表1 Continued table 1

“-”表示未检测到“-” indicate not detected

图3 不同区试谷子品种风味特征OPLS-DA

通常用VIP来选择偏OPLS-DA模型中的要素。本模型中18种VIP大于1的化合物可用于区分不同样品的差异，即2,4-癸二烯醛、(,)-3,5-辛二烯-2-酮、2-(2-丙烯基)-呋喃、己醛、2-戊基呋喃、2-乙酰基噻唑、庚醛、(,)-2,4-癸二烯醛、3,5-辛二烯-2-酮、()-3-壬烯-2-酮、苯甲醛、十四酸、2-戊基呋喃、(Z)-2-庚烯醛、庚醇、2-甲氧基-苯酚、乙基苯、十六酸甲酯（图3-C）。

3 讨论

3.1 谷子香气化合物成分分析

醛类一般具有青草、脂肪、橄榄等香气，在谷物中普遍存在，其中己醛、壬醛，在燕麦、大麦、大米[18-19]等谷物中被证实为较高含量的挥发性成分，但长期储存时，这些物质会对谷物风味产生负面影响。醛通常来自谷物中存在的不饱和脂肪酸的碳-碳双键的自动氧化和酶解氧化[20]。高温蒸煮过程中，脂类降解会有大量的醛类物质产生[21-22]，报道称谷子的脂肪酸组成包括亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸和花生四烯酸等[12]，它们在小米煮粥过程中会降解，()-2-癸烯醛和C7—C9烷烃类主要是油酸氧化的产物，(,)-2,4-壬二烯醛和2-烯醛主要衍生自亚油酸。Bi等[23]也把煮粥引起的()-2,4-庚二烯醛、(,)-2,4-壬二烯醛、()-2-癸烯醛和()-2,4-癸二烯醛4种二烯醛含量的增加归因于亚麻酸的降解，它们为小米粥带来了脂肪和坚果味。研究表明较高温度储存小米会产生己醛、()-2-壬烯醛和辛醛等脂肪酸氧化的产物，它们对小米保存不利。小米中的醇类通常通过脂肪酸的仲氢过氧化物的分解形成，例如1-辛醇主要通过油酸的氧化产生，1-辛烯-3-醇和1-己醇主要来源于亚油酸的分解。

酚类化合物也是谷子中一类重要的香气活性化合物，主要在米糠中存在。其中愈创木酚类化合物有烟熏味，在发酵谷物制品[24]、郫县豆瓣酱、日本味噌和朝鲜大酱[25-26]中有2,6-二甲氧基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、4-甲基愈创木酚等酚类的报道，并且被鉴定为关键香气化合物。证实了大部分酚类化合物是由阿魏酸热降解或谷物发酵时酵母代谢产生的[27-28]。

酮类的香气一般为青草香、果香。然而，由于酮类的高气味阈值，这些化合物对谷子的香气贡献较小。已有研究表明不饱和脂肪酸的自动氧化可以形成酮[17]，例如油酸氧化可产生2-庚酮。脂类的氧化会对谷物的生理生化代谢产生不良影响，降低储藏谷物的质量[20]。

碳氢化合物和苯衍生物在谷子中较为常见，其中碳氢类一般阈值较高，一般为10—18个碳原子的烷烃或烯烃。烷烃被认为是植物的内源性物质，起源于长链脂肪酸的脱羧[29]。碳氢类化合物具有较高的阈值，对谷子的气味起平衡作用。而含量相对较低的含苯衍生物可能会对谷物的香气产生贡献，但大多数是负面的，如芴、菲等物质，推断可能是环境污染所致，谷物中很少有此类物质生成。

十四酸、(,)-9,12-十八二烯酸、十五酸、十六酸4种酸类均为长链，分析应该是高温蒸煮所致。另外还有呋喃类、噻唑类等杂环类和一种酯类被检测到，包括呋喃、2-(2-丙烯基)-呋喃、2,3-二氢苯并呋喃和2-戊基呋喃等，其中2-戊基呋喃具有甘草和豆类的香气，是亚油酸的次级氧化产物[30]。不同谷子化合物种类和含量的一些差异可归因于品种、生长条件、收获后储存条件和所采用试验方法的差异。

3.2 香气活性值及差异化合物筛选分析

虽然每个区试谷子品种检测到了几十种挥发性物质，但不是所有物质都对谷子的香气特征有贡献，OAV值分析可鉴定风味物质对香气的贡献。醛类在谷子的风味中起着重要作用，以(,)-2,4-癸二烯醛为例，它在东北区和华北区的OAV值相差较大，具体到品种九谷和冀谷19，两个品种的OAV分别为586.57和6 307.57，两者相差十倍；庚醛、()-2-庚烯醛、苯甲醛在东北区和华北区的OAV值都为0，明显不同于西北区和内蒙古区以上化合物有OAV贡献的情况。雷达图也表明这些化合物之间的含量和风味贡献差异可能就是品种间口味不同的原因之一。

值得注意的是，VIP的筛选与OAV的筛选有所区别，VIP的筛选是在OPLS-DA模型下各含量对模型的贡献值，OAV的筛选是基于各化合物含量及阈值的香气贡献，筛选结果会有部分重合。因此，基于VIP值，结合单向多变量分析特征风味化合物可更有效地筛选差异化合物[30]。

4 结论

4个生态区12个品种谷子共鉴定出81种芳香活性化合物，其中醛类25种，醇类6种，酚类4种，酮类11种，碳氢类11种，含苯衍生物13种，酸类4种，其他7种，OAV>1的有23种。4个生态区各谷子品种在风味化合物数量、含量以及特征香气贡献上均有不同。OPLS-DA筛选出VIP关键化合物18种，包括己醛、庚醛、()-2-庚烯醛、苯甲醛、(,)-2,4-癸二烯醛、2,4-癸二烯醛、壬烷、十四烷酸、(,)-9,12-十八烷酸、十五烷酸、正十六烷酸、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2,4-双(1,1-二甲基乙基)-苯酚、2,5-双(1,1-二甲基乙基)-苯酚、1-庚醇、橙花醇、2-戊基呋喃和十六烷酸甲酯，OPLS-DA模型能够有效区分不同地区的谷子品种，具有良好的适应性和可预测性。

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Aroma Characteristics of Foxtail Millet Varieties from Different Ecological Regions by Analysis of SDE-GC-MS Combined with OPLS-DA

1Institute of Biotechnology and Food Science, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050051;2Shijiazhuang Livestock Products and Veterinary Feed Quality Testing Center, Shijiazhuang 050041

【Background】The foxtail millet production areas in China are divided into four regions: the Northeast China region, the North China region, the Inner Mongolia plateau region, and the Northwest China region. The regional trials aimed to screen germplasm resources with good genetic traits. However, good growth genetic traits and foxtail millet grain appearance phenotypes do not necessarily have good culinary quality and aroma characteristics, especially the aroma characteristics largely affect its production and downstream industries. Simultaneous distillation extraction (SDE) is a pretreatment method that simulates the cooking process of porridge and is suitable for the aroma analysis of foxtail millet.【Objective】The aim of this study was to clarify the aroma characteristics of cereal germplasm resources in different ecological regions, so as to promote sensory-oriented breeding-processing industrial practices.【Method】Simultaneous distillation extraction-gas chromatography-mass spectrometry (SDE-GC-MS) combined with odor activity value (OAV) method was used to analyze the differences in aroma components of foxtail millet in different regions of China.【Result】 A total of 81 volatile substances were detected in 12 foxtail millet varieties from four ecological regions, 25 aldehydes, 6 alcohols, 4 phenols, 11 ketones, 11 hydrocarbons, 13 benzene-containing derivatives, 4 acids, and 7 others. The comparison of the results showed that the volatile substance subclasses were similar in different regions, but the contents of the components were different. Thirty-seven volatile components with literature-accessible odor characterization were labeled, and 23 contributing aroma compounds with OAV > 1 were identified in the 12 foxtail millet varieties. The effective discrimination model of the cereal regional test was established by orthogonal partial least squares discrimination analysis (OPLS-DA). Then, the 12 foxtail millet varieties were classified into three categories, and 18 compounds with VIP>1 were screened out: hexanal, heptanal, ()-2-heptenal, benzaldehyde, ()-2, 4-decadienal, 2,4-decadienal, nonane, tetradecanoic acid, ()-9, 12-octadecadienoic acid, pentadecanoic acid, n-hexadecanoic acid, 2-methoxy-4-vinylphenol, 2, 4-bis(1, 1-dimethylethyl)-phenol, 2, 5-bis(1, 1-dimethylethyl)-phenol, 1-heptanol, nerolidol, 2-pentyl-furan, and hexadecanoic acid methyl ester, which could be used to distinguish the differences between different samples.【Conclusion】 SDE-GC-MS combined with OAV identification analyzed the flavor components and characteristics of key aroma compounds of foxtail millet from different ecological regions, and the OPLS-DA model screened 18 VIP compounds that distinguished the flavor differences of foxtail millet from different samples and ecological regions. The results of the study provided data references for understanding the differences in flavor characteristics of foxtail millet grown in different regions of China, and for a basis of flavor-oriented foxtail millet variety selection, breeding, and processing.

simultaneous distillation extraction; foxtail millet; odor activity value; ecological regions; orthogonal partial least squares discriminant

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.13.012

2022-10-27；

2023-05-17

国家自然科学基金面上项目（31771902）、财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助（CARS-06-14.5-A29）

李少辉，E-mail：lishaohui007@163.com。通信作者刘敬科，E-mail：liujingke79@163.com

（责任编辑 赵伶俐）