应用生物信息学方法结合细胞实验探究Plakophilin-1（PKP1）在皮肤黑色素瘤中的生物学作用

张崇海 秦倩

【摘 要】目的 探索PKP1在皮肤黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）中相关生物学功能。方法 通过实时TIME 2.0数据库分析PKP1在不同的腫瘤以及正常组织中的相对表达量；通过GEPIA以及UALCAN数据库分析PKP1在皮肤黑色素瘤组织以及正常组织的表达量以及探究PKP1的表达水平和肿瘤病人预后的关系；在SK-MEL-1细胞系中，过表达PKP1探究对于肿瘤细胞的影响。结果 TIME 2.0分析显示，多种肿瘤组织中PKP1表达水平低于正常组织（P<0.05）；而胆管癌、肝癌以及肾透明细胞癌等肿瘤中PKP1表达水平高于正常组织（P<0.05）；GEPIA数据库分析显示，正常组织中PKP1表达水平高于皮肤黑色素瘤组织（P<0.05）；PKP1过表达组PKP1的蛋白水平高于NC组（P<0.05）；PKP1高表达组OS指标优于低表达组（P<0.05）；CCK8实验显示，PKP1过表达组与空质粒组细胞OD值比较，统计学意义显著（P<0.01）。结论 PKP1在皮肤黑色素瘤中低表达，其表达水平下调和预后不良有关，PKP1可以抑制皮肤黑色素瘤细胞的增殖，PKP1有成为靶向治疗的关键基因的潜力。

【关键词】皮肤黑色素瘤；PKP1；生存时间；细胞增殖；靶向治疗

中图分类号：R739.5 文献标识码：A 文章编号：1004-4949（2023）13-0044-04

The Biological Role of Plakophilin-1 （PKP1） in Cutaneous Melanoma Based on Bioinformatics Methods Combined with Cell Experiments

ZHANG Chong-hai， QIN Qian

（Department of Dermatology， Xuecheng District Peoples Hospital， Zaozhuang 277099， Shandong， China）

【Abstract】Objective To explore the biological function of PKP1 in skin cutaneous melanoma （SKCM）. Methods The relative expression of PKP1 in different tumors and normal tissues was analyzed by real-time TIME 2.0 database. The expression of PKP1 in cutaneous melanoma tissues and normal tissues was analyzed by GEPIA and UALCAN databases， and the relationship between the expression level of PKP1 and the prognosis of tumor patients was explored. In SK-MEL-1 cell line， the effect of overexpression of PKP1 on tumor cells was explored. Results TIME 2.0 analysis showed that the expression level of PKP1 in various tumor tissues was lower than that in normal tissues （P<0.05）， while the expression level of PKP1 in cholangiocarcinoma， liver cancer and renal clear cell carcinoma was higher than that in normal tissues （P<0.05）. The GEPIA database showed that the expression level of PKP1 in normal tissues was higher than that in skin melanoma tissues （P<0.05）. The protein level of PKP1 in PKP1 overexpression group was higher than that in NC group （P<0.05）. The OS index of PKP1 high expression group was better than that of low expression group （P<0.05）. CCK8 assay showed that the OD value of PKP1 overexpression group was statistically significant compared with that of empty plasmid group （P<0.01）. Conclusion PKP1 is lowly expressed in cutaneous melanoma， and its down-regulation is related to poor prognosis. Meanwhile， PKP1 can inhibit the proliferation of cutaneous melanoma cells， and has the potential to become a key gene for targeted therapy.

【Key words】Skin cutaneous melanoma； PKP1； Survival time； Cell proliferation； Targeted therapy

皮肤黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）作为一种常见的皮肤恶性肿瘤，其发生于表皮基底层的黑色素细胞，具有极易侵袭和转移的生物学特点[1，2]。正是由于癌细胞恶性程度较高，使得癌症的进程发展迅速，很多患者确诊时已经是中晚期，失去了手术治疗的最佳时机。因此，针对皮肤黑色素瘤有着较高的发病率以及致死率这些问题，临床需要去发现一些有价值的肿瘤标志物以及有效的治疗靶点用于癌症的诊断以及治疗。Plakophilin-1（PKP1）是armrepeat（armadillo）和plakophilin基因家族的成员，它是桥粒的重要组成部分。从既往的研究发现[3]PKP1的异常表达和许多癌症的进程有关，比如，在肺癌中，PKP1 发挥了肿瘤抑制因子的角色，其蛋白表达可作为晚期肺癌患者的潜在预后标志物；在乳腺癌中，miR-328a/Pkp1信号通路参与了乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭过程[4]；PKP1在食管癌中，其表达水平与癌症分级呈负相关，它有作为肿瘤标志物的潜力预测病人的预后[5]。但是PKP1在皮肤黑色素瘤中的相关作用并未见明确报道，本研究旨在利用TCGA数据库对于PKP1在皮肤黑色素瘤的是否涉及相应的生物学作用进行探究。

1 材料与方法

1.1 不同肿瘤中PKP1表达水平的探究 利用TIMER 2.0数据库在不同的肿瘤组织和正常组织中PKP1的表达水平进行了分析，旨在初步探究PKP1在不同癌种中的表达情况。

1.2 方法

1.2.1皮肤黑色素瘤组织和正常组织中的PKP1的表达差异 首先利用GEPIA数据库（数据源于TCGA和GTEx数据库），单独探究PKP1在皮肤黑色素瘤和正常组织中的表达水平是否具有差异，其中分析时参数|Log2FC|Cutoff值为1，p-value Cutoff值小于0.01；为了更全面探究PKP1在组织中的表达情况，利用UALCAN数据库（多用于探究目标基因以及确定肿瘤亚群特异性候选生物标志物），探究在原发性癌组织以及转移性癌组织中PKP1的表达情况，旨在分析对于PKP1在不同病理因素下皮肤黑色素瘤中 PKP1是否具有差异表达。

1.2.2 PKP1的表达水平 对于肿瘤病人预后的影响 利用GEPIA 2数据库，探究目的基因PKP1的表达水平是否和皮肤黑色素瘤患者的预后产生影响，主要观察的指标包括总生存时间（Overall Survival）以及无复发生存时间（Recurrence free survival）。

1.2.3细胞的培育和转染 利用SK-MEL-1细胞（人皮肤黑色素瘤细胞）进行细胞的培养（培养液：MEM+10%FBS+1%P/S；培养条件：37 ℃，5%CO2）；PKP1過表达质粒和阴性对照（NC），质粒的构建由苏州吉玛基因公司完成。

1.2.4蛋白表达水平的测定 为了检测转染的效率，应用免疫印记实验进行不同处理组细胞蛋白水平的检测，待细胞密度生长至 80% 以上，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗细胞3次，用蛋白裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白并计算蛋白浓度，调整两组细胞间总蛋白浓度均等。经聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、抗体免疫反应、化学发光、成像。

1.2.5 CCK8实验对于SK-MEL-1细胞增殖能力的调控作用 通过CCK8实验进行检测，按照CCK8试剂说明书的要求，对照组和过表达组细胞均分别在12、24、36、48、60 h 5个时间点进行检测，CCK8试剂加样10微升进入每个检测空，避光孵育2 h后上样检测，在450 nm波长处测 OD值。

1.3 统计学方法 不同组织之目的基因的表达量的差异使用配对t检验，数据分析用mean+SD表示，患者的生存差异、生存曲线绘制分别使用log-rank检验和K-M法。

2 结果

2.1 PKP1在多种肿瘤组织中异常表达 TIME 2.0分析显示，在多种肿瘤，如卵巢癌（BRCA），肾嫌色细胞癌（KICH），以及肾乳头状细胞癌（KIRP）等肿瘤组织中PKP1的表达水平低于正常组织（P<0.05）；而在胆管癌（CHOL），肝癌（LIHC）以及肾透明细胞癌（KIRC）等肿瘤中PKP1的表达水平高于正常组织（P<0.05），见图1。

2.2 皮肤黑色素瘤组织中PKP1的表达差异 GEPIA数据库分析结果显示，正常组织中，PKP1的表达水平高于皮肤黑色素瘤组织（P<0.05）。

2.3 PKP1高表达的患者总生存时间更长 将黑色素瘤的患者分为PKP1高表达组以及PKP1低表达组，以OS作为观察的指标，结果显示PKP1高表达组优于低表达组（P=0.00031），见图3。

2.4 PKP1过表达后蛋白水平的验证 过表达PKP1后，通过蛋白水平对于NC组细胞和过表达PKP1组细胞的验证显示，PKP1过表达组PKP1蛋白水平高于NC组，见图4。

2.5 PKP1抑制SK-MEL-1的增殖 CCK8实验显示，过表达PKP1后，PKP1过表达组与空质粒组细胞OD值相比，差异显著（P<0.01），见图5。

3 讨论

皮肤黑色素瘤是皮肤肿瘤中常见的恶性肿瘤之一，目前皮肤黑色素瘤的患病率仍处于明显的上升趋势[6，7]。当下对于皮肤黑色素瘤的治疗，外科手术仍是使得患者获得长期生存的最有效治疗手段。但是由于皮肤黑色素瘤恶性程度较高，相当一部分患者不再具备手术切除的条件。因此，其他有效的治疗方式对于癌症患者的治疗显得尤为重要。随着靶向治疗的兴起，针对特定靶基因，可以达到延缓癌症的进展甚至有可能达到癌症治愈的结局[8，9]。而PKP1作为靶向治疗研究的目的基因，在其他癌症中，已经显示出了巨大的研究潜力。有学者在鳞状细胞肺癌中研究发现[10]，通过CRISPR-Cas9技术敲除细胞中的PKP1，可以有效地抑制癌细胞的增殖，因此PKP1有作为肺癌中治疗的一个靶点进行相关研究的潜力；同时国外的学者研究发现[11]，PKP1在前列腺癌中类似抑癌基因，在癌细胞中敲低PKP1的表达，降低了细胞的凋亡率，从而导致了癌症的进展；另外有研究发现[12]，在头颈部鳞状细胞癌中，PKP1的表达水平在癌症中高表达，体现出致癌基因的作用；由此说明PKP1在多种癌症中可发挥着重要的生物学功能，因此其作为一个有效的治疗靶点，具有很大的研究潜力。而关于PKP1在皮肤黑色素瘤中的作用并未深入探究，因此本研究主要针对PKP1是否有潜力在皮肤黑色素瘤中作为治疗的靶点进行相关的探索。

本研究结果显示，PKP1不仅在多种癌症中表达水平异常，而且在皮肤黑色素瘤中，其癌组织中PKP1的表达水平明显低于正常组织，这些结果说明了高表达的PKP1在皮肤黑色素瘤中，有可能扮演着抑癌基因的角色，从而抑制了癌症的进展。此外，TCGA数据进行患者的生存分析也印证了这一点，高表达组PKP1的患者其生存时间长于低表达组患者，提示PKP1完全有可能成为一个有效的肿标志物指导皮肤黑色素瘤患者的预后[13-15]。而且通过细胞实验，进一步证实了PKP1的异常表达和肿瘤的增殖水平密切相关。

综上所述，PKP1在皮肤黑色素瘤中有作为肿瘤标志物有指导患者预后的可能，且实验过程体现了PKP1有作为关键靶点的研究价值，通过针对PKP1进行靶向治疗，对于今后皮肤黑色素瘤的治疗提供了研究线索。

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編辑 柴泛宇