基于叶片解剖结构的澳洲坚果种质资源抗旱性评价

马静 贺熙勇 陶亮 吴超 李志强 宫丽丹

摘 要：研究澳洲坚果种质资源叶片解剖结构并评价其抗旱能力，为澳洲坚果良种选育及引种栽培提供理论依据。利用石蜡切片技术，分析比较20 份澳洲坚果種质资源的11 项叶片解剖结构特征参数，运用主成分分析法、隶属函数法和系统聚类法对不同种质资源的抗旱性进行综合评价。结果表明：澳洲坚果叶片为典型的异面叶，不同种质资源的叶片解剖结构指标间均存在极显著差异（P<0.01）。采用主成分分析法得出11 项指标反映澳洲坚果抗旱能力的顺序为：栅栏组织厚度>叶片厚度>叶片结构紧密度>栅海比>叶片结构疏松度>上表皮角质层厚度>下表皮厚度>上表皮厚度>下表皮角质层厚度>中脉厚度>海绵组织厚度。采用隶属函数法，结合各指标所占的权重，得出20 份澳洲坚果种质资源的抗旱性顺序为：1 号>19 号>5 号>10 号>14 号>11 号>16 号>7 号>2 号>20 号>8 号>13 号>18 号>15 号>9 号>3 号>6 号>4号>17 号>12 号。将抗旱性度量值经过“Z-score”标准化后进行聚类分析，在遗传距离15 处，20 份种质资源分为三大类群。1 号、5 号、10 号、11 号、14 号、16 号和19 号的叶片较厚，栅栏组织发达，栅海比和叶片结构紧密度明显高于其他种质，具有较高的保水和光合能力，为高抗旱类群；3 号、4 号、6 号、9 号、12 号、15 号和17 号的叶片、表皮及角质层偏薄，且叶片结构疏松度较高，表现出较低的抗旱能力，为低抗旱类群；其余种质抗旱能力居中。

关键词：澳洲坚果；种质资源；叶片解剖结构；抗旱性

中图分类号：S602.4 文献标识码：A

澳洲坚果（Macadamia spp.）为山龙眼科澳洲坚果属常绿乔木果树，原产于澳大利亚昆士兰东南部和新南威尔士东北部沿岸的亚热带雨林地区[1]。因其果仁营养丰富、味美可口，被誉为“坚果之王”和“干果皇后”[2-3]。我国澳洲坚果主要分布于云南、广西、贵州、广东等地，种植面积超过了全球种植面积的1/2[4]。由于全球气候变化及我国种植区多为山地，土壤水分成为澳洲坚果生长及增产的主要限制因子之一[5-7]，因此，筛选抗旱澳洲坚果种质资源对产业的快速发展具有重要意义。

植物叶片对环境变化最为敏感且可塑性较强，其解剖结构特征最能反映植物对干旱等环境的适应能力[8]。近年来，许多学者基于叶片解剖结构开展了植物的抗旱性研究。郭燕等[9]比较了36 个京津翼主栽板栗品种的叶片解剖结构，并对其抗旱等级进行分类，结果表明该评价结果与采用叶片保水力的评价结果较为一致。王烟霞等[10]研究发现叶片解剖结构能较好地反映杨树的抗旱性，并筛选出角质层厚度、叶片厚度和CTR为主要评价指标。丁祥等[11]通过叶片组织结构比较了新疆葡萄砧木的抗旱性，筛选出5 个抗旱性较强的砧木品种。范志霞等[12]比较了成都地区10 种园林灌木的叶片解剖结构，筛选出适宜屋顶、边坡区域种植的强抗旱性植物。在核桃[13]、南丰蜜橘[14]、平欧杂种榛[15]等植物的研究中也发现，植物的抗旱性与叶片解剖结构存在一定的相关性。澳洲坚果的抗旱性研究多集中于生理指标方面[16-18]，而通过叶片解剖结构对澳洲坚果抗旱性进行评价的研究未见报道。本研究比较澳洲坚果不同种质资源叶片的解剖结构，对其抗旱性进行初步评价，为澳洲坚果良种选育及引种栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供试材料均为10 年生成龄结果树（表1）。于2020 年8 月，每个品种选取长势基本一致的3 株植株，每株随机选用3 片新梢自上而下第2 轮成熟叶备用。

1.1.2 研究地区概况 试验地位于农业农村部景洪澳洲坚果种质资源圃（ 100°46′42.24″E ，22°00′50.40″N），属北热带湿润季风气候，年均气温18～22 ℃，年均降水量1200～1700 mm，年日照时数1800～2100 h。试验地平均海拔550 m，土壤类型为红壤，pH 4.05～4.35。

1.2 方法

将叶片擦拭干净，垂直叶脉横切，取叶片中下部具叶脉1.0 cm×1.0 cm 的小块，用FAA 固定液（70%乙醇∶冰醋酸∶甲醛=18∶1∶1）固定24 h以上。然后将样品移入植物软化液（ G1115-500 ML，购自武汉塞维尔生物科技有限公司）中，55 ℃软化2 周。待组织软化后采取常规石蜡切片法[19]制片，切片厚5 μm。采用PANNORAMIC全景切片扫描仪（3DHISTECH， Hungary）对叶片组织信息进行扫描，并使用CaseViewer 2.2 扫描浏览软件观察、拍摄。成像完成后， 使用Image-Pro Plus 6.0 分析软件测量叶片解剖结构指标（图1），包括叶片厚度（leaf thickness， LT）、上表皮厚度（upper epidermis thickness， UET）、下表皮厚度（lower epidermis thickness， LET）、上表皮角质层厚度（upper cuticle thickness， UC）、下表皮角质层厚度（lower cuticle thickness， LC）、栅栏组织厚度（palisade parenchyma thickness， PT）、海绵组织厚度（spongy parenchyma thickness， ST）及中脉厚度（midrib thickness， ML）。每份种质制作3 个样片，每叶片观测5 个视野，所有测量数据均取15 个视野的平均值。并按如下公式进行计算：

栅海比（palisade/spongy tissue， P/S）＝栅栏组织厚度/海绵组织厚度

叶片结构紧密度（cell tense ratio， CTR）＝栅栏组织厚度/叶片厚度

叶片结构疏松度（sponge ratio， SR）＝海绵组织厚度/叶片厚度

1.3 数据处理

采用Excel 2010 和SPSS 23.0 软件进行数据处理分析。运用主成分分析法确定各指标的权重，结合隶属函数法，加权求和得出澳洲坚果不同种质的抗旱性度量值[20-21] 。将抗旱性度量值“Z-score”标准化后进行聚类分析（欧氏距离）。

2 结果与分析

2.1 叶片解剖结构特征比较

20 份澳洲坚果种质资源叶片的横切面结构基本相同。由图1 可知，澳洲坚果是典型的异面叶，主要由上表皮细胞层、下表皮细胞层、栅栏组织、海绵组织和维管束组成，且上下表皮细胞层外均覆有角质层。上表皮细胞排列规则，由一层椭圆形或矩形的细胞构成。栅栏组织呈圆柱状，有2～3层，排列紧密且垂直于表皮细胞。海绵细胞排列疏松，形态不规则，中间有大量的间隙。澳洲坚果的叶脉发达，主脉上下突起，维管束排列均匀紧密。气孔分布于下表皮。

由表2 可知，11 项叶片解剖结构指标在澳洲坚果种质资源间均存在极显著差异（P<0.01）。20份澳洲坚果种质资源的叶片厚度在269.55～336.12 μm 之间，19 号最厚，12 号最薄。上表皮（10.56～19.60 μm）及上表皮角质层（6.16～8.72 μm）分别比下表皮（10.08～14.72 μm）及下表皮角质层（ 3.29～4.99 μm） 厚。栅栏组织厚度在84.48～121.21 μm 之间，海绵组织厚度在144.78～188.27 μm之间，栅海比为0.53～0.76，11 号最高，3 号最低。

叶片结构紧密度在0.29～0.37 之间，叶片结构疏松度在0.49～0.58 之间。中脉厚度在477.73～1309.50 μm 之间，其中20 号最厚，17 号最薄，二者相差2.74 倍。各解剖指标的变异系数在4.58%～19.69%之间，由大到小依次为：中脉厚度>上表皮厚度>栅海比>栅栏组织厚度>下表皮角质层厚度>下表皮厚度>海绵组织厚度>上表皮角质层厚度>叶片结构紧密度>叶片厚度>葉片结构疏松度。

2.2 抗旱指标权重确定

20 份洲坚果种质资源在叶片厚度、上表皮、下表皮等11 项指标均存在极显著差异，具有一定的代表性。因各指标之间存在一定的相关性，反映的信息在一定程度上有重叠，故对11 项指标进行主成分分析，计算各指标在反映抗旱性时所占的权重。由表3 可知，经主成分提取后前4 个主成分的累计贡献率达到88.684%，说明前4 个主成分较好地保留了11 个指标的绝大部分信息。在第1 主成分中，CTR 和P/S 的载荷值较高，主要是与叶片机械支撑和光合能力相关的因子。在第2 主成分中，叶片厚度和海绵组织厚度的载荷值较高，主要是与疏导水分相关的因子。在第3 主成分中，上下表皮厚度的载荷值较高，主要是与提高叶片贮水能力相关的因子。在第4 主成分中，上下表皮角质层厚度的载荷值较高，主要是与保护叶片细胞相关的因子。

将LT、UET、LET、UC、LC、PT、ST、P/S、CTR、SR、MT 分别记为X1～X11，用主成分分析得到的数值分别除以各主成分对应的特征值的算术平方根，求得主成分F1、F2、F3、F4 的表达式分别为：

F1=0.100X1+0.158X2+0.106X3–0.036X4+0.151X5+0.371X6–0.170X7+0.470X8+0.476X9–0.424X10–0.093X11

F2＝0.559X1+0.005X2+0.090X3+0.289X4–0.050X5+0.360X6+0.546X7–0.039X8+0.031X9+0.158X10+0.075X11

F3=0.168 1+0.646X2+0.683X3+0.392X4–0.009X5+0.124X6+0.030X7+0.082X8+0.022X9–0.174X10+0.580X11

F4=0.070X1–0.049X2–0.038X3+0.564X4+0.865X5+0.055X6–0.104X7+0.166X8+0.036X9–0.283X10+0.233X11

根据4 个主成分的权重，计算主成分的表达式为：

F=（λ1F1+λ2F2+λ3F3+λ4F4）/（λ1+λ2+λ3+λ4），式中：λ1、λ2、λ3、λ4 分别为4 个主成分的特征根[20]。即：

F＝0.242X1+0.166X2+0.175X3+0.189X4+0.144X5+0.295X6+0.078X7+0.222X8+0.228X9–0.199X10+0.095X11

上述表达式中，指标前系数越大，权重越大，越能反映植物的抗旱性。由表达式可看出，11 项反映澳洲坚果抗旱性的指标由高到低依次为：栅栏组织厚度>叶片厚度>叶片结构紧密度>栅海比>叶片结构疏松度>上表皮角质层厚度>下表皮厚度>上表皮厚度>下表皮角质层厚度>中脉厚度>海绵组织厚度。

2.3 抗旱性综合评价

运用隶属函数法，得出20 份澳洲坚果种质资源11 项指标的隶属函数值，结合主成分分析法求出的各指标权重，综合计算抗旱性度量值，据此对澳洲坚果的抗旱性进行排序。由表4 可知，20份澳洲坚果种质资源的抗旱性由强到弱依次为：1号>19 号>5 号>10 号>14 号>11 号>16 号>7 号>2号>20 号>8 号>13 号>18 号>15 号>9 号>3 号>6 号>4 号>17 号>12 号。

2.4 种质聚类分析

将20 份澳洲坚果种质资源的抗旱性度量值经过“Z-score”标准化后进行聚类分析（图2）。

在遗传距离15 处，可将20 份澳洲坚果种质分为三大类。其中，第Ⅰ类为高抗旱类型，包含1 号、5 号、10 号、11 号、14 号、16 号和19 号；第Ⅱ类为中抗旱性类型，包含2 号、7 号、8 号、13号、18 号和20 号；第Ⅲ类为低抗旱类型，包含3号、4 号、6 号、9 号、12 号、15 号和17 号。

3 讨论干旱是影响植物生长和发育最主要的非生物胁迫因素之一[22]，在干旱条件下，为了适应或缓解逆境，植物的生理代谢和结构特征会发生一定的改变[23]。叶片直接暴露于空气中，对环境条件的反应最为敏感，其解剖结构特征对植物的抗旱性分析具有一定的指示作用[24]。植物叶片越厚，储水能力越强[25]。较大的表皮细胞有利于提高植株的水分调节能力[26]。厚的角质层能防止体内水分过度蒸腾，同时具有较强的折光性，能防止强日照引起的损伤。此外，角质层还具有机械支撑作用，在植株水分供应不足时，不会立即萎蔫[27]。

栅栏组织发达，可促进光合作用，并能防止干旱时的水分蒸发。海绵组织疏松，有助于CO2 等气体的传导，从而提高植物对水分的利用率[19]。叶脉是运输水分和养分的重要器官，发达的主脉更有利于适应干旱环境[28]。在本研究中，20 份澳洲坚果种质的叶片解剖结构基本相似，具有不同程度的抗旱特征，如叶片总体较厚，上表皮细胞较大，排列规则，且上下表皮细胞层外均覆有角质层；栅栏组织发达，海绵组织疏松；主脉发达，维管束排列均匀紧密。但不同种质的叶片解剖结构特征参数均存在极显著差异，在生长过程中表现出不同的适应性。

植物抗旱性的评价方法主要有主成分分析法、隶属函数法、聚类分析和灰色关联度分析等[26]。

运用单一的方法进行评价具有一定的片面性，本研究分析比较了20 份澳洲坚果种质的叶片解剖结构指标，采用主成分分析法得出了各项指标对抗旱性的贡献，根据各指标所占的权重结合隶属函数计算出抗旱性度量值，最后运用聚类分析方法进行分类，提高了澳洲坚果抗旱性评价的准确性。本研究结果与其他作物的研究结果有相似之处，也存在不同[21， 29]，表明不同作物在干旱環境中采取的抗旱机制不同。选育抗旱品种是提高果树抗旱性最根本的途径。本研究仅利用叶片解剖结构指标对20 份澳洲坚果种质的抗旱性进行了初步评价，但植物的抗旱性是由多基因控制的性状，不仅与自身的形态特征和生理生化特性有关，同时受环境条件和栽培措施的影响，要形成更全面可靠的评价体系，还需要结合遗传基因、生理生态和田间管理等多方面加以综合考虑。

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