基于DNA条形码技术的虹鳟分子鉴定

李昭楠，李长忠，保长虹，贺彩霞，金文杰，陈艳霞

(青海大学生态环境工程学院，青海 西宁 810016)

黄河流域是中国重要的生态屏障和经济地带，整个流域的生态保护和高质量发展已经成为国家战略。青海省地处黄河源头，拥有天然有鱼水域131.36×104hm2、宜鱼水域5.49×104hm2，水体洁净、水质优良，常年水温在3～22 ℃之间，冬季不封冻、无大风浪，是养殖鲑鳟等冷水鱼的理想场所，也是国内外公认的养殖鲑鳟条件较好的地区之一[1-2]。近年来，青海省黄河沿岸的鲑鳟网箱养殖始终坚持生态优先的理念，保持了稳步发展的势头，高原冷水鱼品牌的优势显现，青海省也成为国内最重要的鲑鳟生产基地[3]。

目前，国内外市场三文鱼的销售量稳步增加，挪威、芬兰和美国分别以生产大西洋鲑(Salmosalar)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和阿拉斯加鲑(Oncorhynchusnerka)为主，中国以生产虹鳟为主。虹鳟是鲑科的一员，在世界范围内具有重要的生态价值[4]。其中，三倍体虹鳟因体内有三套染色体、无法进行减数分裂、不能产生精子和卵子以及不存在性腺发育等特点，具有生长快、肉质好、个体大和能够有效防范物种入侵[5]等优势，而成为黄河上游青海段的主要养殖品种，促进青海省冷水养殖产业的效益稳步提升。目前，有关三倍体虹鳟的研究主要集中在能量代谢[6-7]、发育过程[8-9]以及不同发育阶段基因的表达[10-11]等方面，在鱼种鉴定方面鲜有报道。市售的三倍体虹鳟主要以冰鲜、腌制和烟熏的形式存在，急需一种有效的鉴定方法，以利于保护消费者的合法权益，规范市场监管。

随着现代生物学技术的不断发展，鱼类的物种鉴定研究已逐渐从形态学方法转向形态学和分子生物学相结合的方法[12]。DNA作为生物体最核心的信息遗传载体，其遗传序列直接决定了生物体的本质。以DNA为基础的分子检测技术由于具有较高的灵敏度、特异性、可靠性，己成为鱼类物种鉴定的主要检测技术[13]。分子鉴定技术主要包括随机引物 PCR(Arbitrarily primed PCR，AP-PCR)、随机扩增多态性 DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、扩增性简单序列重复(Inter-simple sequence repeats，ISSR)、限制性内切酶切片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、扩增限制性内切酶片段长度多态性(Amplified restriction endonuclease fragment length polymorphism，AFLP)、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)和DNA条形码(DNA-barcode)序列分析[14]等。其中，DNA条形码在物种鉴定中具有独特的优势，即可以根据整条鱼、鱼片、鱼鳍、鱼卵或组织碎片的样本识别鱼类物种，仅需要少量样本即可进行DNA条形码检测。此外，即使是加工处理的样品，也可以应用DNA条形码对其进行物种鉴别[15]。目前，DNA-barcode和Mini-barcode技术已被广泛用于鱼种鉴定，其通过扩增部分COⅠ序列作为条形码，以此对物种进行准确鉴定，但该技术应用于近缘物种、杂交种和变种之间的鉴定尚未被明确。本研究以三倍体虹鳟、二倍体虹鳟及其变种金鳟、大西洋鲑、大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)和高白鲑(Coregonuspeled)为研究对象，利用COⅠ基因对虹鳟进行DNA条形码研究和系统进化分析，探讨COⅠ基因在分子鉴定中的适用性，为虹鳟的物种鉴定提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

三倍体虹鳟、金鳟、二倍体虹鳟和大西洋鲑样品各3条，分别采自青海省海东市、循化县、化隆县和门源县；冰鲜大麻哈鱼和高白鲑样品各3条，分别购自库尔勒爱果电子商务有限公司和哈尔滨龙德食品有限公司。取以上鱼类的背部肌肉组织，置于-80 ℃保存备用。

1.2 DNA提取及引物设计

使用DNA提取试剂盒(TIANGEN，Code No.DP304)提取上述鲑科鱼类肌肉组织基因组DNA，通过紫外分光光度计(Implen，NanoPhotometer N60)测定各样本的浓度和纯度。以质量合格的DNA为模板，分别扩增6种样本鱼的DNA barcode和Mini barcode，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。通过NCBI数据库下载10种鲑科鱼类CO Ⅰ基因序列(表1)，经Clustal X[16]对比后，选取保守区序列，利用Primer Premier 5软件分别设计两对DNA barcode、Mini barcode引物用于虹鳟鉴定(表2)，所有引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 鲑科鱼类COⅠ基因信息

表2 PCR引物信息

1.3 PCR反应体系、反应条件及产物分析

PCR反应体系为20 μL，包括：Premix Taq 10 μL(Takara，Code No.RR902A)，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL(浓度为10 μmol/L)，ddH2O补充反应体系至20 μL。CO Ⅰ-1 PCR反应条件：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃结束。CO Ⅰ-2 PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃结束。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA 2000 Marker(Takara，Code No.3427A)判定PCR产物片段大小与引物产物片段大小的一致性。

1.4 测序及数据分析

将符合要求的PCR产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，数据使用DNAStar软件中的SeqMan程序[17]进行序列拼接，再利用Clustal X[16]对比查找上下游引物位置。将处理好的序列在NCBI数据库进行比对，并基于相似性、覆盖度和综合评分来确定样品的种属信息。为分析虹鳟的系统发育关系，从NCBI查找COⅠ基因序列长度为600 bp左右的17个鲑科物种(表3)，应用MEGA 7.0[18]中的邻接法(Neighbor-joining method，NJ)[19]构建系统进化树。

表3 17个鲑科物种的COⅠ基因信息

续表3

2 结果与分析

2.1 PCR扩增及序列分析

各样本基因组DNA浓度在100～200 ng/μL之间,A260/280比值在1.9～2.1之间(表4),均满足后续PCR扩增的要求(图1)。对于扩增长度为681、678 bp的DNA barcode而言,所有样品均得到单一明亮的条带,因此选择引物CO Ⅰ-F24和CO Ⅰ-R24进行基因测序分析。对于扩增长度为153、230 bp的Mini barcode而言,引物TEYL-1扩增后大西洋鲑与高白鲑条带较暗(图2),故使用TEYI-0F和TEYI-0R引物扩增出的片段进行测序分析。

表4 各样本DNA质量检测结果

注：M为DL 2000分子质量标准；1～6使用COⅠ-F24、COⅠ-R24引物；7～12使用COⅠ-F25、COⅠ-R25引物；1、7为三倍体虹鳟；2、8为金鳟；3、9为二倍体虹鳟；4、10为大西洋鲑；5、11为大麻哈鱼；6、12为高白鲑。

2.2 测序结果分析

将测序得到的DNA barcode和Mini barcode序列拼接处理后，基于NCBI数据库检索比对，结果表明本研究扩增得到的6种鱼的CO Ⅰ基因信息同NCBI数据库中的已知物种信息匹配度与覆盖度均在97%以上。相比于DNA barcode序列，Mini barcode序列的最高匹配度较低，由表5可知，DNA barcode比对结果均为100%，而Mini barcode中只有大西洋鲑比对结果为100%，这可能是因为Mini barcode序列长度较短(153 bp)，而长片段(DNA barcode)中个别碱基的缺失、插入及突变会对结果产生较大的影响。通过BLAST发现待测样本高白鲑应为欧白鲑(Coregonusalbula)，可能存在标签误贴的情况。本研究以CO Ⅰ作为单一靶基因，可对虹鳟和其他鱼种进行区分，但对于近缘物种和变种不能区分，需要寻找新的鉴别手段。

表5 6种鲑科鱼基于DNA条形码技术物种鉴定结果

2.3 系统发育分析

三倍体虹鳟属于鲑科，鲑科有3个亚科11个属，分别基于DNA barcode和Mini barcode构建鲑科鱼类系统发育树(图3、图4)。两个聚类结果基本一致。鲑科17个物种聚为2大支，其中白鲑亚科和茴鱼亚科聚集在一起，鲑亚科聚集在一起，表明白鲑亚科和茴鱼亚科的亲缘关系较近。每个鱼种独立分支，由于三倍体虹鳟是由二倍体虹鳟和四倍体虹鳟杂交出的全雌性虹鳟，金鳟为二倍体虹鳟的变种，因此三倍体虹鳟、金鳟、二倍体虹鳟和虹鳟聚为一支；测序后大西洋鲑和大麻哈鱼的序列也与在NCBI上下载的序列(MN850430.1、MN880432.1)聚集在一起，表明其亲缘关系最近；测序后高白鲑的序列与NCBI下载的欧白鲑、高白鲑聚集在一起；白鲑属(Coregonus)、茴鱼属(Thymallus)聚在一起，麻哈鱼属(Oncorhynchus)、副哲罗鱼属(Parahucho)、哲罗鱼属(Hucho)、红点鲑属(Salvelinus)、鳟属(Salmo)聚在一起，表明此系统发育树可信。

3 讨论

遗传学方法的优点之一是从任何年龄动物的活体或死体身上收集的一个小组织样本就包含了完整的核和线粒体基因组信息。通过比较基因组选定区域内的中性或保守变异，可以在个体水平上进行鉴定[20]。本研究利用此原理进行采样后虹鳟与其他鱼种的区分。相比较蛋白质检测方法，利用DNA鉴别更为简便，它比蛋白质更耐高温，在不利的环境条件下仍然有可能通过聚合酶链式反应扩增小的DNA片段用于鉴定，DNA还存在于生物体的几乎所有细胞中，可以从任何基质中被提取[21]。DNA分子标记能够直接反映特种DNA分子水平上的差异[22]。DNA条形码技术是利用线粒体基因的短序列来识别物种，应用于特定生物分类群的DNA条形码标记，对物种边界、群落生态学、功能性状进化、营养相互作用和生物多样性保护等研究具有重要意义[23]。DNA条形码技术因准确、经济、高效的特性而备受关注，比较适合鉴别较高经济价值的鱼种[24]。

随着全球贸易鱼类产品的种类和类型的增加，产品标签错误的案例也在增加，而其发生有不同的原因。在某些情况下，当鱼肉具有类似的物理性质(颜色、质地)，并且通过加工去除鱼鳍和头部等形态特征时，鱼会被错误地识别为其他种类。Nedunoori A等[25]利用DNA条形码技术结合BOLD识别引擎和本地组装的条形码库，对来自食品店的22个冷冻鱼和鱼片样本进行了误标调查，研究发现白眼鳕鱼被错标为鳕鱼片，罗非鱼无法被准确识别。利用DNA条形码技术，Cline E等[26]对来自美国华盛顿西部商店和餐馆的鲑鱼样本进行了检测，以确定大西洋鲑鱼取代了太平洋鲑鱼，在99个鲑鱼样本中，有11个(11%)是货真价实的；超过38%的餐厅样本被错误标记物种，而有7%的商店样本被错误标记。Clark L F等[27]讨论了鱼类价值链中标签错误和替代问题的范围、公共和私营部门目前使用的条形码以及进一步实施的一些建议。本研究中发现高白鲑存在标签误贴现象，实际应该为欧白鲑，结果同时证明利用DNA条形码技术可以对物种进行鉴定。

在鱼类条形码研究中，通常用于物种鉴定的DNA标记是线粒体DNA(mtDNA)中一个648 bp的区域，被称为COⅠ基因。现有的分子鉴定研究通常使用DNA barcode、Mini barcode或二者与其他基因相结合的方法进行物种鉴定，例如Chang C等[28]、Zahn R J等[29]和Sultana S等[30]分别利用650、130、259 bp的COⅠ基因与141 bp的18S rRNA基因对台湾鱼、鲨鱼和20种商品鱼进行鉴定，结果均显示该方法可行。尽管DNA条形码技术在鱼类物种鉴定方面已逐渐成熟，但其鉴别能力受到许多因素的影响。其中，数据库脆弱性和标本误认是主要因素[31]。本研究中使用681 bp的DNA barcode和153 bp的Mini barcode相结合的方法，对虹鳟及其他鲑科鱼进行鉴定，可以有效地减少在测序过程中因碱基缺失或者错配而产生的误差，可在结果上相互验证，使结果更有说服力；系统发育树的结果表明，此方法可用于虹鳟的鉴定，为其产业的健康发展提供理论依据。

关于鲑科鱼类的系统发育分析，目前常用的方法有NJ法和最大似然法(Maximum likelihood estimate，MLE)[32-33]。本研究使用NJ法对三倍体虹鳟、金鳟、二倍体虹鳟、大麻哈鱼、大西洋鲑、高白鲑和其他17种鲑科鱼类的线粒体基因组构建系统发育树。结果显示，白鲑属、茴鱼属聚在一起，麻哈鱼、副哲罗鱼属、哲罗鱼属、红点鲑属、鳟属聚在一起。本研究所构建的系统发育树与李瑶瑶等[34]根据鲑科鱼cytb基因构建的系统发育树和孙毅[35]依据鲑科鱼COX1基因构建的系统发育树结果一致，佐证了本研究结果的可靠性。基于序列BLAST和进化树分析发现，检测的6种鱼类样本中高白鲑存在标签误贴的情况，这在鱼类消费市场中常有发生[36-37]，故各种鱼类鉴定方法的建立对规范市场具有重要意义。

金鳟为虹鳟的变种[38]，二者拉丁名一致，基于线粒体基因组无法被区分，因此需探索其他可对二者进行鉴定的方法。Stephens M R等[39]利用SNP技术对掺入金鳟中的虹鳟进行了区分，本课题组后续将对该方法的适用性做进一步验证。在鱼类中，三倍体是由一个四倍体产生的配子与一个二倍体产生的配子通过受精方式结合的，三倍体化被普遍认为是不育鱼大规模生产最实用、经济和有效的方法[40]。本研究结果显示，三倍体虹鳟、金鳟和二倍体虹鳟的COⅠ基因序列及系统发育树结果一致，且测序发现三倍体虹鳟和二倍体虹鳟线粒体基因组完全一致，故基于mtDNA无法对三者进行区分和鉴定。已有研究发现，依据核基因可鉴定三倍体虹鳟、金鳟和二倍体虹鳟[41-42]，但该方法对样本来源要求较高，无法被广泛应用于加工样本的鉴定。综上所述，本研究开发的DNA条形码可将虹鳟与其他鲑科鱼类进行区分，这将为虹鳟物种鉴定及产业的健康发展提供技术支撑。

4 结论

本研究开发的DNA条形码技术可区分虹鳟与其他鲑科物种，但对于三倍体虹鳟、二倍体虹鳟和金鳟之间不能区分，需要寻找新的鉴定方法对变种进行区分。