4个柞蚕品种对人工饲料的适应性及其SOD、CAT酶活性差异分析

韩 冰，郭天凯，全 爽，李喜升，杜占军

（辽宁省蚕业科学研究所，辽宁 凤城 118100）

柞蚕（Antheraea pernyi）是我国传统的经济昆虫，已有2 000多年的历史[1]，是重要的资源昆虫之一。我国柞蚕茧年产量约9.5 万t，占世界的90%以上，每年柞蚕产业可创造可观的经济价值[2]。柞蚕为野外饲养，受气候条件影响比较大，当前农村劳动力又严重不足。工厂化养蚕是集品种改良、饲料调配、蚕病防治、环境控制等多项技术于一体的规模化、标准化、集约化现代养蚕方式[3]。人工饲料工厂化养蚕可以在小蚕期进行科学、统一规范管理，实现工厂化养蚕生产、缓解劳动力不足[4]、柞园资源有限等问题。

家蚕人工饲料研究中发现，家蚕不同个体与群体之间、品系与品种之间在摄食性方面均存在显著差异[5]，选育出适宜饲料育的蚕品种将极大地促进人工饲料在生产中的推广应用[6]。因此，在柞蚕人工饲料前期研究工作中首先开展了7 个柞蚕生产主推品种的小蚕期人工饲料适应性调查工作，通过起蚕率和存活率等指标比较分析，最终筛选出本研究中4个对柞蚕人工饲料适应性相对较好的柞蚕品种，并进一步开展了这4个柞蚕品种的小蚕期适应性及野外放养饲育调查工作。

1 材料与方法

1.1 供试柞蚕品种

供试柞蚕品种/品系为9906、抗大、辽蚕527和大9，均由辽宁省蚕业科学研究所提供。

1.2 柞蚕人工饲料来源及处理方法

本试验采用的是柞树叶粉含量为40%的粉体饲料，主要成分为柞树叶粉、玉米粉、大豆蛋白、玉米芯粉等，由辽宁省蚕业科学研究所研制。使用前将所有原料均匀混合后加入2 倍的纯净水，揉至光滑团状放入蒸锅内蒸煮40 min，室温放置2 h后4 ℃冷藏备用。

1.3 柞蚕小蚕人工饲料育适应性调查方法

将小蚕期人工饲料育设为试验组，1~2龄人工饲料育，3龄起蚕后移到野外进行放养；全龄鲜叶育设为对照组，1~2龄鲜叶育，3龄起蚕后移到野外进行放养。柞蚕小蚕人工饲料适应性调查设置3个重复区，每区100头；4 个柞蚕品种试验组与对照组饲育成绩调查设置4 个试验区，每区300 头，4 个对照区，每区200 头。整个小蚕试验期间，饲养温度均设置为26 ℃，人工饲料饲养期间避光，相对湿度控制在75%，每次换料进行通风换气。取食率、起青率、结茧率及死笼率的计算公式为：

1.4 不同龄期柞蚕体抗氧化酶的活性测定

1.4.1 幼虫待测样本提取 分别在4个品种/品系柞蚕每龄初期取样。每个时期分别取小蚕饲料育和鲜叶育幼虫各15头，用浓度为75%的乙醇擦拭蚕体表面进行消毒，然后用无菌水清洗体壁3次，用消毒后的吸水纸吸干幼虫体表水分。2龄和3龄小蚕取全蚕，测试前将蚕体用锡箔纸包裹放入液氮中迅速冷冻，然后研磨至粉末状后放入-80 ℃冰箱冷冻保存备用；4龄和5龄由柞蚕第3腹足处取血淋巴，每组随机取15头柞蚕幼虫的血淋巴，3次重复，分别置于离心管中，血淋巴充分混合后于液氮中迅速冷冻，并移入-80 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.4.2 酶活性的测定 2龄和3龄小蚕测定SOD、CAT活性时，采用全蚕组织测定，需先测定待测样品蛋白含量值，然后使用SOD和CAT组织专用试剂盒进行测定；4龄和5龄柞蚕幼虫取血淋巴进行SOD、CAT的活性测定，取样方法参考湛苗苗等[14]使用的方法进行。组织酶活测定及血淋巴酶活测定方法均参照对应试剂盒说明书，试剂盒由南京建成生物工程研究所生产，在实验室使用岛津UV2600紫外可见分光光度计测定试验组与对照组柞蚕幼虫各龄期起蚕时血淋巴中的SOD和CAT。

1.5 数据分析

使用SPSS数据处理软件对试验数据进行方差分析，用LSD 法对4个柞蚕品种/品系不同饲育方式下的2龄取食率、2龄起青率、饲育成绩及不同龄期的SOD、CAT酶活性进行平均数的多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同柞蚕品种/品系小蚕人工饲料育适应性调查

由表1可知，2龄小蚕取食率，各品种小蚕饲料育均显著低于对照鲜叶育。小蚕饲料育条件下，品种间无显著差异，取食率最高的品种为大9，达82.33%，最低的为9906，达77.33%。收蚁7 d小蚕起青率各品种小蚕饲料育均显著低于对照鲜叶育，小蚕饲料育条件下，品种间无显著差异，起青率最高的品种为抗大，达60.33%，最低的为9906，达53.67%。整体来看，小蚕期人工饲料育与鲜叶育还存在一定差距，同时结合小蚕取食率与收蚁7 d起青率两方面综合分析考虑，抗大和大9在小蚕期对人工饲料的适应性相对较好。

表1 不同柞蚕品种/品系蚕期人工饲料育适应性调查Table 1 Investigation on adaptability of artificial diet among different Antheraea pernyi varieties/strains at young tussah stage

2.2 不同柞蚕品种/品系小蚕人工饲料育饲育成绩调查

由表2可知，小蚕人工饲料育的条件下，品种间结茧率存在显著差异，抗大显著高于9906，与辽蚕527和大9 差异不显著；与对照组相比，各品种间结茧率均低于对照组；试验组死笼率与对照组相比，均达到10%以上。试验组品种间全茧量无显著差异，与对照组相比均低于对照组，茧层量调查结果同全茧量。茧层率结果表明，试验组中抗大显著高于9906 和大9，与辽蚕527 间差异不显著；与对照组相比，试验组都显著低于对照组。综上小蚕人工饲料育各品种饲育成绩均显著低于对照鲜叶育。小蚕饲料育条件下，结茧率、死笼率、茧层率3个指标各品种间存在显著差异，其中抗大在结茧率、茧层率方面表现最优，辽蚕527在死笼率方面表现最优。

表2 不同柞蚕品种/品系小蚕期人工饲料育饲育成绩调查Table 2 Investigation of rearing results of artificial diet among different Antheraea pernyi varieties/strains at young tussah stage

2.3 不同柞蚕品种/品系小蚕人工饲料育不同龄期SOD活性比较

2.3.1 不同柞蚕品种/品系小蚕人工饲料育2龄和3龄小蚕组织中SOD活性比较 由表3可知，2龄和3龄起蚕时，抗大SOD活性小蚕饲料育均显著高于对照鲜叶育，其他品种与对照间无显著差异；小蚕饲料育条件下，品种间同样具有显著差异，抗大、辽蚕527和大9 SOD活性显著高于9906，同时发现同品种间SOD活性随龄期增长的增高，其中增高幅度最大的品种为抗大。综上，在2龄、3龄起蚕时不同饲育方式下不同品种之间SOD活性均存在显著差异。

①外寒内热：《圣济总录·卷一百十六》：“鼻之窒者，或冷风乘肺，或肺经壅热。冷热同异，其塞则一，皆肺脏不和，气不宜通故也。治塞者，当审其冷热”。这告诉我们，在治本病时，应对寒热和虚实，要有准确的辨证。

表3 不同柞蚕品种/品系人工饲料育2和3龄小蚕组织中SOD活性Table 3 Comparison of SOD activity from 2 and 3 young Antheraea pernyi tissue in artificial diet among different Antheraea pernyi varieties/strains at young stage

2.3.2 不同柞蚕品种/品系小蚕人工饲料育4龄和5龄大蚕血淋巴中SOD活性比较 由表4可知，4龄起蚕时，抗大和辽蚕527小蚕人工饲料育SOD活性显著高于对照鲜叶育，小蚕人工饲料育品种间无显著差异；5龄起蚕时，9906、辽蚕527和大9人工饲料育SOD活性显著高于对照鲜叶育，小蚕人工饲料育品种间具有显著差异，以抗大的SOD活性最高。同时发现，小蚕人工饲料育条件下各品种5龄SOD活性均比4龄期小幅度下降，分析原因为小蚕刚从室内移到野外时生存环境发生较大变化，保护酶系统发生反应引发SOD酶活性较高，在野外适应一个龄期后逐渐趋于平稳，其中抗大和辽蚕527小蚕人工饲料育条件下在4龄和5龄起蚕时的SOD活性均为最高，说明这两个品种从室内小蚕饲料育移至野外后对环境的适应性相对较好。要优于全龄鲜叶育，更适合小蚕人工饲料育。

表4 不同柞蚕品种/品系小蚕人工饲料育4龄和5龄大蚕血淋巴中SOD活性Table 4 Comparison of SOD activity from 4 and 5 young Antheraea pernyi hemolymph in artificial diet among different A.pernyi varieties/strains at young stage

2.4 不同柞蚕品种小蚕人工饲料育不同龄期CAT酶活性比较

2.4.1 不同柞蚕品种小蚕人工饲料育2和3龄小蚕组织中CAT活性 由表5可知，2龄起蚕时试验组各品种间存在显著差异，抗大显著高于9906和辽蚕527，与大9之间差异不显著。与对照组相比，抗大显著高于对照组，其他品种与对照组间无显著差异。3龄起蚕时试验组品种间CAT酶活性存在显著差异，抗大和大9显著高于9906，与辽蚕527间无显著差异；与对照组相比，各品种与对照组均无显著差异，同时发现，整体来看同一品种CAT活性随龄期增长呈增高趋势，大9的增幅最高。综上，4个品种的在2龄和3龄人工饲料育时CAT酶活性均为抗大最高。

表5 不同品种（品系）柞蚕小蚕人工饲料育2龄和3龄小蚕组织中CAT活性Table 5 Comparison of CAT activity from 2 and 3 young Antheraea pernyi tissue in artificial diet among different Antheraea pernyi varieties/strains at young stage

2.4.2 不同柞蚕品种小蚕人工饲料育4龄和5龄大蚕血淋巴中CAT活性 由表6可知，4龄起蚕时，不同品种试验组间差异显著，抗大显著高于9906，与辽蚕527、大9 无显著差异；试验组与对照组相比，均无显著差异。5龄起蚕时，试验组品种间SOD酶活性无显著差异；试验组与对照组比较，均不存在显著差异。总的来看，4龄起蚕和5龄起蚕试验组品种间CAT活性整体呈下降趋势，并且试验组均高于对照组，说明人工饲料育小蚕移到野外后应激反应比全龄鲜叶育更强烈。

表6 不同柞蚕品种（品系）小蚕人工饲料育4龄和5龄大蚕血淋巴中CAT活性Table 6 Comparison of CAT activity from 4 and 5 young Antheraea pernyi hemolymph in artificial diet among different Antheraea pernyi varieties/strains at young stage

2.5 人工饲料育起青率及结茧率与抗氧化酶活性相关性分析

2.5.1 人工饲料育小蚕期起青率与2龄SOD、CAT活性的相关性分析 为了探究人工饲料育的小蚕起青率与SOD、CAT酶活是否存在一定相关性，利用统计学对各品种人工饲料育的起青率与2龄SOD、CAT酶活性进行双变量相关性分析，分析结果见表7。通过分析结果的皮尔逊相关系数可以看出，2龄起青率与相应龄期的SOD、CAT酶活性呈显著正相关。

表7 人工饲料育小蚕期起青率与2龄SOD、CAT活性的相关性分析Table 7 Correlation analysis of green rate and SOD and CAT activity of Antheraea pernyi rearing at the second instar in artificial diet

2.5.2 人工饲料育柞蚕结茧率与5龄SOD、CAT活性的相关性分析 由表8可知，5龄结茧率与相应龄期的SOD、CAT酶活性呈显著正相关。通过分析结果的皮尔逊相关系数可以看出，5龄结茧率与相应龄期的SOD、CAT酶活性呈显著正相关。由此推测，SOD、CAT活性可作为衡量柞蚕人工饲料适应性的指标之一。

表8 人工饲料育结茧率与5龄SOD、CAT活性的相关性分析Table 8 Correlation analysis of cocooning rate and SOD and CAT activity of Antheraea pernyi rearing at the fifth instar in artificial diet

3 讨论与结论

在家蚕人工饲料研究中，常用取食率、起蚕率、饲育成绩等指标进行适应性调查工作。柞蚕与家蚕生活习性差异较大，在野外放养过程中受气候条件等自然因素影响较大[15]。柞蚕人工饲料育小蚕期饲育环境稳定，因此在适应性调查工作中还需考虑人工饲料育小蚕移到野外后的适应能力。超氧化物歧化酶（SOD）是氧自由基的天然清道夫，生物体内SOD活性高低是衰老与死亡的直观指标，CAT可以催化机体内的过氧化氢（H2O2）分解为H2O 和O2，从而保护机体组织免受损伤[16-17]。在逆境下，保护酶活性上升的幅度大，速度快，蚕体自我调节能力强，具有更强的适应性[18-19]。严银龙等[20]对不同饲料对刀鲚幼鱼抗氧化酶活性研究结果中可知抗氧化酶反应能力与样本对饲料的适应程度相关。本试验研究结果表明，抗氧化酶活性与人工饲料育适应性呈显著正相关，说明在开展柞蚕人工饲料育适应性品种选育工作时不同饲育龄期的抗氧化酶活性分析也很有必要。

本试验结果表明，抗大、辽蚕527 和大9 在小蚕期对人工饲料的适应性较好。饲育成绩方面，抗大饲育成绩最佳；小蚕期在室内饲养期间试验组2龄和3龄人工饲料育的SOD、CAT酶活性均高于鲜叶育，分析原因为人工饲料营养均衡，消毒彻底，可以为小蚕提供更丰富的营养物质，其中人工饲料育辽蚕527 和大9 的SOD 酶活显著高于另外2 个品种，抗大CAT 活性最高，说明辽蚕527、大9 和抗大对饲料适应性较强。4 龄和5 龄人工饲料育的SOD、CAT 酶活性也都高于鲜叶育，辽蚕527 和大9 在4 龄和5 龄的SOD 酶活最高，抗大在4 龄和5 龄时CAT 酶活性最高。综合考虑品种间对人工饲料的适应性、饲育成绩、不同龄期SOD、CAT 酶活性差异三方面因素，初步确定抗大、辽蚕527和大9适宜作为人工饲料适应性品种选育材料。

柞蚕为野外柞园中饲养，因此应重视小蚕从室内移到野外的适应性变化。人工饲料育柞蚕蛹死笼率较高，分析原因：一方面人工饲料虽然营养丰富，但是柞树叶一直是柞蚕的最佳食物来源，小蚕虽取食饲料但并非喜食；另一方面，柞蚕小蚕期一直在室内饲养盒内饲养，温湿度恒定，饲料均匀平铺，无需向上攀爬即可取食。因此，移到野外后攀爬能力相对较弱，造成遗蚕率高、结茧率低、死蛹率高的结果。因此，加速推进柞蚕人工饲料适应性品种选育工作、制定科学规范的柞蚕人工饲料饲育技术规程尤为重要。下一步将结合本研究试验结果进一步开展柞蚕人工饲料适应性品种选育等研究内容，争取早日实现柞蚕小蚕人工饲料工厂化这一目标。