贵州白山羊FHL3基因多态性与生长性状关联分析

安清明 杨驰 宋兴超 赵园园 陈敏 申建江 高伟

摘要：筛选贵州白山羊FHL3基因单核苷酸变异位点（SNPs），并分析基因多态性与生长性状的关联性，为培育贵州白山羊优良品系提供参考依据，也为进一步研究FHL3基因生物学功能奠定基础。通过混合池测序对116只不同地区贵州白山羊FHL3基因进行SNPs鉴定，以188只贵州白山羊进行关联性分析。采用PopGene32.0软件计算等位基因频率、基因型频率、遗传纯合度（Ho）、期望杂合度（He）、有效等位基因数（Ne），应用PIC软件计算群体多态性信息含量（PIC），以卡方（χ2）检验分析基因Hardy-Weinberg平衡状态；应用MINTAB软件中的一般线性混合效应模型分析核苷酸变异与生长性状关联性。结果表明，贵州白山羊FHL3基因的6个检测区域中，仅在P3区域检测到1个核苷酸变异位点g.215 C/T，且该位点的Ho低于He，PIC检测为中度多态，χ2检验结果表明，该位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P<0.05）。关联分析结果表明，贵州白山羊FHL3基因g.215 C/T位点变异构成的不同等位基因和基因型在体高、体长和胸围方面表现出显著差异性（P<0.05），存在等位基因C的群体和CC基因型群体具有更高的生长优势。贵州白山羊FHL3基因具有一定的多态性，且g.215 C/T位点变异与体高、体长和胸围具有显著相关性，可作为培育贵州白山羊优良品系的候选基因分子标记。

关键词：贵州白山羊；FHL3基因；生长性状；关联分析

中图分类号：S827.2  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）13-0049-05

LIM是3种转录因子Lin-11、Lsl-1和Mec-3的缩写，是一类富含特征性氨基酸保守序列的蛋白超家族，该家族基因中含有一类介导转录因子、信号通路蛋白及细胞骨架相关蛋白之间相互作用的一个重要区域，是LIM蛋白与其他蛋白互作调节胚胎发育、细胞分化和细胞骨架形成等重要生物学功能的结构基础［1-3］。4个半LIM结构域蛋白3基因（FHL3）属于FHL（Four and a half LIM domain）基因家族，该家族共有5个成员，即FHL1、FHL2、FHL3、FHL4、FHL5/ACT［4］。FHL3基因的cDNA序列全长为843 bp，共编码281个氨基酸，相对分子质量为31 181.92 ku，FHL3基因位于人1号染色体短臂的末端，包含6个外显子和5个内含子［5］。FHL家族在不同组织中存在表达特异性，如FHL1在骨骼肌中表达水平最高，并参与肌球蛋白丝的合成以及肌小结的排列，FHL2在心脏中表达量最高，但在骨骼肌中微表达，FHL4和FHL5目前仅在睾丸组织中发现具有一定表达量［6］。较长时间，学者将研究目标主要集中于FHL1和FHL2基因上，对FHL3基因的研究较少。有研究发现，FHL3也主要在骨骼肌中表达，但在心肌中表达匮乏［7］。FHL3蛋白可通过和肌动蛋白（actin）结合负向调控肌动蛋白成束，且在迁移的成肌细胞中，过表达FHL3可增加并诱导应力纤维解聚［8］。Han等研究发现，FHL3是卫星细胞向成肌细胞肌管分化和融合的负调控因子，Cottle等研究也发现，FHL3可负向调控肌肉发育、损害MYOD基因的转录活性，从而抑制肌细胞分化过程［9-10］。Zhang等研究也发现，在生肌过程中FHL3蛋白能与CREB蛋白互作形成复合体，通过介导CREB基因的转录促进MyHCⅡα的表达，进而抑制MyoD基因的转录活性［11］。以上研究表明，FHL3是调节骨骼肌分化、生成及细胞结构的重要调控基因。

在畜牧生产中，研究发现猪FHL3基因在第2外显子处第313碱基处存在1个A/G错意突变，且该突变与猪的肉质性状和眼肌面积具有显著相关［12-13］。亦有研究表明，FHL3基因表达量与猪肉的肉质评价指标具有一定关联性，如猪肉的肌肉色泽、吸水力、pH值、肌肉嫩度、肌内脂肪含量等［14-15］。在羊中，张鑫通过转录组测序发现，FHL3基因是影响寒泊羊肉品质和产肉量的重要候选基因［16］。课题组前期通过转录组测序也发现，FHL3基因是影响贵州白山羊生长和产肉量的重要候选基因［17］。但目前，在畜牧生产中关于FHL3基因变异与生产性状关联分析的研究极少，山羊中更鲜见研究报道，鉴于FHL3基因是动物生产性状关联的重要候选基因，因此，本研究拟分析FHL3基因的核苷酸变异及其与贵州白山羊生长性状的关联性，以期能够筛选出可用于指导贵州白山羊生长性状遗传改良的分子标记位点。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2022年2—6月在铜仁学院贵州省梵净山地区生物多样性保护与利用重点实验室完成。课题组2021年6月至2022年2月收集贵州白山羊试验数据，其中，贵州省铜仁市德江县2家养殖合作社36只、沿河县2家养殖合作社42只、遵义市务川县3家养殖合作社38只，共116只白山羊血液用于多态性检测，以铜仁市沿河县、遵义市务川县2家养殖合作社的188只贵州白山羊（2周岁龄及以上）作为研究对象用于生长性状关联分析。所有山羊颈静脉采血约5.0 mL，-20 ℃保存备用。用于测定生长性状的所有羊在禁食24 h后，测定个体的生长性状数据，包括体质量、体高、体长、胸围。采用试剂盒提取（北京天根生化科技有限公司）DNA，所有DNA -20 ℃保存備用。其中，用于多态性检测的116个样本DNA用TE调整至相同浓度，每管DNA取5 μL制成混合DNA，以备后续PCR混合池测序筛选核苷酸变异位点。

1.2 引物的设计与PCR扩增

根据GenBank山羊的FHL3基因序列（登录号：NC_030810.1），采用Primer Premier 5.0软件设计6对引物，包括FHL3基因的5′UTR区，外显子区、内含子区和3′UTR区，引物位置详见图1，不同引物序列信息见表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应体系为25.0 μL，其中，DNA模板1.0 μL，上下游引物各1.25 μL，2 Master Mix试剂12.5 μL，灭菌超纯水9.0 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s（各引物退火温度见表1），72 ℃延伸60 s，37 个循环；最后延伸10 min。待反应结束后，4 ℃冰箱保存。PCR产物上样于1.5%的琼脂糖凝胶，120 V电压条件下电泳15 min，在凝胶成像分析系统下观察试验结果。将目的条带清晰的PCR产物样品纯化后送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.3 数据统计及分析

利用Lasergene中的MegAlign程序进行序列比对并判定基因型；利用PopGene 32.0计算等位基因频率、基因型频率、遗传纯合度（Ho）、期望杂合度（He）、有效等位基因数（Ne），平衡χ2检验；利用PIC软件计算群体多态信息含量（polymorphism information content，PIC）。应用MINTAB（Version 16，Minitab Inc.，Pennsylavania）一般线性混合效应模型（General Liner Mixed-effect Models，GLMMs）评估特定等位基因的存在/缺失、基因型是否对贵州白山羊生长性状存在影响。

对某一特定基因性状进行存在、缺失分析模型中，等位基因或基因型、性别、年龄为固定因素，遵从下列模型进行最小二乘方差分析：

Yijmn=μ+Gi+Cj+Fm+Xn+eijmn。

其中，Y为相应性状，μ为群体均值，Gi为年龄效应，Cj为性别效应，Fm为基因型、等位基因效应，Xn为因素間互作效应，eijknm为随机误差。所有结果均采用“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 贵州白山羊FHL3基因核苷酸变异分析

以贵州白山羊混合DNA为模板扩增6段FHL3基因片段，由测序结果（图2）可知，引物P1、P2、P4、P5和P6扩增目的片段基因中未发现核苷酸变异位点，但在P3引物扩增片段中发现1处变异，为g.215 C/T突变。

2.2 贵州白山羊FHL3基因多态性分析

对188份贵州白山羊进行多态性分析，结果（表2）表明，FHL3基因P3片段中g.215处存在1处核苷酸变异位点，形成等位基因T和C，其频率分别为47.07%、52.93%；构成3种基因型，分别是TT、CT、CC，其频率分别21.28%、51.60%、27.13%；多态信息含量表明，该位点杂合度高于纯合度，且属于中度多态（0.25

2.3 山羊FHL3基因变异与生长性状关联性分析

在FHL3基因P3片段上鉴定出的2个等位基因C和T，两者频率均>5%，可用于生长性状关联分析。等位基因存在与缺失分析结果（表3）表明，等位基因对成年白山羊体质量影响不显著（P>0.05），而对白山羊体高、体长和胸围均有显著影响（P<0.05），且存在等位C的群体生长性状均显著高于缺失群体；基因型关联分析结果（表4）表明，CC基因型的群体在体高、体长和胸围3个生长性状中均显著高于TT型群体，因此等位基因C可作为贵州白山羊生长性状的优势标记基因。

3 讨论

贵州白山羊是著名的地方白山羊品种之一，是贵州当前群体数目最大的山羊品种，是发展贵州畜牧业的重要种质资源。但存在个体小、生长速度慢、饲料转化率低缺点，严重限制了白山羊产业的发展，因此，本研究以前期转录组测序筛选出与贵州白山羊生长相关候选基因FHL3为研究对象，分析其遗传变异及对贵州白山羊生长性能的影响。目前，已有部分学者对FHL3进行了一定的研究，如Cottle等研究表明，FHL3基因在骨骼肌中表达最为显著［10］。李文涛采用转基因小鼠模型研究发现，FHL3基因对不同肌纤维类型形成的存在一定影响［18］。许海洋对转FHL3基因小鼠骨骼肌进行分析，结果表明高度表达FHL3基因能够促进肌肉量增多，且FHL3基因可能对肌肉损伤修复、肌萎缩造成的肌肉消瘦起到一定的修复作用［19］。Meeson等研究发现，FHL3能够协助性调节肌原细胞群和骨骼肌再生，且发现FHL3和SOX15在调节肌肉的数量和骨骼肌的再生中共同发挥作用［20］。从已有研究来看，FHL3能与其他基因互作参与肌细胞的分化调节、骨骼肌的形成等相应的生物学过程，而骨骼肌是影响动物生长性状的一个重要因素，因此本研究针对FHL3基因变异对山羊生长性状的影响具有理论支持。

本研究采用PCR扩增直接测序法，在不同群体白山羊中筛选FHL3基因变异位点，在所选取的6个目的片段中仅发现1个变异位点，且该位点PIC为中度多态水平，表明该基因在群体内的多态水平具有进一步提升的空间。家畜的遗传多态性是长期选择与进化的结果，丰富的多态性有利于进化的多向性，是人工选择和育种的基因基础。已有研究表明，贵州白山羊在多种与生长相关的基因中均有不同程度的多态性，表明贵州白山羊具有很好的选育潜能［21-24］。χ2检验结果表明，该位点处于 Hardy-Weinberg 不平衡状态，这可能是群体在养殖过程中，自然或人工选择导致的结果。而贵州白山羊在养殖过程中自繁自育情况较严重，这也是可能是导致群体多态性不高，变异位点处于偏离 Hardy-Weinberg 平衡状态的一个原因。

在家畜生产中，有关FHL3基因的研究报道较少，仅有报道主要针对猪的生产性状。Zuo等研究发现，猪FHL3基因第2外显子上存在的A/G突变对眼肌面积和肉质性状具有重要影响［12-13］。亦有研究发现FHL3基因与猪肉的色泽、吸水力、嫩度、肌内脂肪含量等性状具有一定影响［14-15］。但目前在山羊中未见相关报道，笔者所在研究团队前期对不同体质量的贵州白山羊进行转录组测序分析发现，FHL3基因是影响山羊生长的重要候选基因。本研究发现，FHL3基因g.215 C/T突变白山羊体高、体长和胸围均有显著影响，但未发现与体质量具有显著相关。研究发现，胸围是影响山羊体质量的直接因素，体高、体长是影响山羊体质量的间接因素［25］。本研究中发现，FHL3基因核苷酸变异对胸围、体高和体长均有显著影响，但却对体质量影响差异不显著，在生产实际中，体尺和胸围性状通常与群体体质量呈正相关，而在本研究中发现，FHL3基因变异与体质量相关性不显著，但在不同基因型分析中发现，CT型群体的体质量值最高，因此推测，等位基因C和T可能在体质量上存在互作影响，杂合型群体的体质量较纯合型高。另外本研究选取研究对象均为成年个体，体尺指标在后续养殖过程中变化不大，贵州牧区的白山羊养殖主要以半舍饲为主，且白山羊的生长速度较为缓慢，本研究结果表明，FHL3基因变异对体质量影响不显著，可能是观测群体育肥效应还未达期望值，表明后期养殖群体还具有很好的育肥增质量空间。但在FHL3基因不同基因型关联分析中发现，基因型CC的群体在体高、体长和胸围3个体尺性状中均显著高于TT型群体，因此FHL3基因可作为贵州白山羊生长性状的遗传标记基因，值得进一步扩大样本进行深入研究。

4 結论

本研究在不同地区贵州白山羊FHL3基因中6个不同区域发现，1个核苷酸变异位点g.215 C/T，且该变异位点与贵州白山羊的体高、体长和胸围生长特征显著相关，存在等位基因C的群体和CC基因型群体具有更好的生长优势。

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