孤儿核受体NR4A1通过NF-κB/COX-2对氧化应激诱导的血栓形成的保护作用及机制研究*

钟华平,李 林,谢家和

赣南医学院第一附属医院:1.心脏ICU;2.血液科;3.心内科,江西赣州 341000

血栓性疾病近年来因其发病率高居各大疾病之首而受到重视,已成为全球疾病负担和人口死亡的重要原因,严重威胁人类健康[1]。孤儿核受体NR4A1是一种即刻早期基因,参与体内多个病理生理过程。NR4A1可通过影响血栓调节蛋白及ET-1的表达抑制血栓形成[2]。然而,仍不能完全解释NR4A1参与调节血栓形成的确切机制。核转录因子-κB(NF-κB)信号通路是经典的炎症信号通路,有研究报道利伐沙班等药物通过NF-κB进而抑制血栓形成[3],但其是否参与由NR4A1调控的血栓形成,国内外相关研究较少见。目前血栓形成病因较多,其中氧化应激是重要的病因之一。本研究拟研究NR4A1对氧化应激诱导的血栓形成的保护作用及其是否通过调节NF-κB/环氧合酶-2(COX-2)信号轴从而调节血栓形成经典下游分子NO/内皮素-1(ET-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、血栓素(TX)A2/前列环素(PGI2)的表达。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取健康SD大鼠30只,雌雄各半,每只体质量200～240 g。适应性饲养1周后,随机分为对照组、模型组和NR4A1组,每组10只。本实验通过赣南医学院实验动物伦理委员会批准,审批号:2022109。

1.2试剂与仪器 壳囊孢菌素B(Csn-B)、3%戊巴比妥钠、4%多聚甲醛(美国Sigma公司);PBS缓冲液(HyClone公司); 无水三氯化铁(FeCl3)试剂(阿拉丁试剂有限公司);硝酸还原酶试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);放射免疫分析试剂盒(北京科美生物技术有限公司);酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(大连TaKaRa公司);电子分析天平(美国Thermo公司);病理切片扫描仪(Hamamatsu公司)。

1.3方法

1.3.1颈动脉血栓模型制备 NR4A1组大鼠灌胃给予10 mg/kg PBS溶解的Csn-B,对照组、模型组大鼠灌胃给予等量PBS。给药1周后,腹腔注射3%戊巴比妥钠(2 mL/kg)麻醉大鼠,取仰卧位固定,分离两侧颈总动脉,右侧颈总动脉备采血用,分离左侧颈总动脉长度3 cm,下置小片塑料薄膜(4 cm×2 cm),保护血管周围组织。模型组、NR4A1组用完全浸透50% FeCl3溶液的滤纸条(2 cm×1 cm)环敷于左侧颈总动脉段上,对照组敷生理盐水滤纸条,30 min后去除滤纸条,去除滤纸条后30 min,从右侧颈总动脉插管取血4 mL,4 ℃ 3 000 r/min离心15 min,分离血清,于-20 ℃保存备用。

1.3.2测定血栓重量 取血后迅速剪下左侧颈总动脉血栓部位血管段,用滤纸吸干表面血液,用电子分析天平称取血栓湿重。

1.3.3观察病理情况 左侧颈总动脉血栓部位血管段称重后,浸泡于4%多聚甲醛中固定,用于苏木精-伊红(HE)染色,并使用病理切片扫描仪对切片进行扫描。

1.3.4测定血清部分指标水平 采用硝酸还原酶法检测NO水平,ELISA法检测ET-1、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、PAI-1的水平,用放射免疫分析法测定TXA2、前列环素(PGI2)的稳定代谢产物TXB2、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)水平。以上检测均按照试剂盒使用说明书进行操作。

1.3.5测定大鼠颈动脉组织蛋白表达水平 取大鼠左侧颈动脉组织剪碎,加入RIPA蛋白裂解液,提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度,得出样品总浓度后进行上样、电泳、转膜、封闭。加入Toll样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白抗原(MyD88)、NF-κB一抗(稀释浓度均为 1∶1 000)4 ℃孵育过夜;清洗,加入二抗(稀释浓度1∶3 000)孵育。按照电化学发光试剂盒说明书进行显色,采用凝胶成像系统扫描图像测定条带灰度值,以GAPDH为内参蛋白,计算NR4A1、NF-κB、COX-2蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠血栓重量比较 对照组未形成血栓[(0.00±0.00)mg],NR4A1组大鼠血栓重量为(4.96±1.42)mg,明显低于模型组的(8.74±2.36)mg,差异有统计学意义(F=75.875,P<0.05)。

2.2各组大鼠颈动脉病理情况 对照组血管结构完整,内皮细胞未见增生或脱落,管腔内无明显血栓形成,管壁均匀。而模型组血管管腔内存在大面积的连续血栓,几乎完全阻断血管,镜下见血管壁变薄,结构不清晰。与模型组相比,NR4A1组血栓形成明显减少,镜下见血管壁各层结构较模型组清晰。

2.3各组大鼠颈动脉组织NR4A1、p-NF-κB p65、COX-2蛋白表达水平比较 模型组与NR4A1组大鼠颈动脉组织NR4A1蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05),且模型组低于NR4A1组(P<0.05);模型组与NR4A1组大鼠颈动脉组织p-NF-κB p65、COX-2蛋白表达水平均高于对照组(P<0.05),且模型组均高于NR4A1组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠颈动脉组织蛋白表达水平比较

2.4各组大鼠血清部分指标水平比较 模型组、NR4A1组大鼠血清NO、eNOS、6-keto-PGF1α水平及NO/ET-1均低于对照组(P<0.05),且模型组均低于NR4A1组(P<0.05);模型组、NR4A1组大鼠血清ET-1、PAI-1、TXB2水平及TXB2/6-keto-PGF1α均高于对照组(P<0.05),且模型组高于NR4A1组(P<0.05)。见表2、图1。

图1 各组大鼠颈动脉组织蛋白印迹图

表2 各组大鼠血清部分指标水平比较

3 讨 论

血栓形成可引起血栓栓塞性疾病,其致死率、致残率较高,而且发病率逐年增加,对人类健康造成极大损害。故寻找抗血栓治疗的潜在靶点具有重要意义。本研究用FeCl3构建颈动脉血栓大鼠模型,通过腹腔注射NR4A1激动剂促进大鼠NR4A1的表达,同时检测NF-κB/COX-2信号轴相关蛋白表达水平及NO/ET-1、PAI-1、TXA2/PGI2的表达,以期分析NR4A1对氧化应激诱导的血栓形成的保护作用机制。

NR4A1广泛表达于各组织、器官。相关研究显示,NR4A1主要参与细胞存活、凋亡、代谢、血管重塑和胆固醇合成等过程,具有调节葡萄糖代谢,调控血管新生,调节内皮细胞功能等作用[4-6]。NF-κB作为炎症的关键转录因子,其激活可调节下游炎症介质COX-2水平。COX-2为诱导型环氧化酶,在生理状态下不表达或低水平表达,出现炎症时其表达上调,通过催化产物前列腺素、TX、细胞间黏附分子等炎症介质参与血栓形成[7]。本研究结果显示,NR4A1组大鼠血栓重量明显低于模型组(P<0.05);模型组大鼠颈动脉组织NR4A1蛋白表达水平低于NR4A1组(P<0.05);模型组大鼠颈动脉组织p-NF-κB p65及COX-2蛋白均高于NR4A1组(P<0.05)。提示上调NR4A1水平,可抑制NF-κB/COX-2信号通路,进而改善颈动脉血栓大鼠模型中血栓情况。有研究发现,抑制NF-κB信号通路,可减轻大鼠深静脉血栓模型中的血栓和炎症[8],与本研究结果一致。

NO和ET-1均为血管内皮细胞合成、释放的血管活性因子,可反映血管内皮功能。NO/ET-1 比值的调节对血栓形成起着重要作用。eNOS可通过释放NO来调节正常的血管张力及血栓阻力,维持内皮细胞的稳态。当血管内皮损伤时,会导致氧自由基生成增加,NO分泌减少。PGI2具有舒张血管,抑制血小板活化,抗血栓形成的作用,6-keto-PGF1α可反映PGI2的水平;TXA2具有强烈的促使血管收缩及活化血小板、促进血栓形成的作用,TXB2可反映TXA2的水平;PGI2和TXA2平衡失调与血栓形成密切相关[9]。PAI-1在纤溶系统中起着决定性作用,能够调节纤维蛋白溶解的过程,进而促进血栓形成并抑制血栓的降解和重塑[10]。本研究中,模型组、NR4A1组大鼠血清NO、eNOS、6-keto-PGF1α水平及NO/ET-1均低于对照组(P<0.05),且模型组均低于NR4A1组(P<0.05);模型组、NR4A1组大鼠血清ET-1、PAI-1、TXB2水平及TXB2/6-keto-PGF1α均高于对照组(P<0.05),且模型组均高于NR4A1组(P<0.05)。提示NR4A1可上调NO、eNOS、6-keto-PGF1α水平及NO/ET-1,下调ET-1、PAI-1、TXB2水平及TXB2/6-keto-PGF1α,进而减轻大鼠颈动脉血栓模型中的血栓和炎症。

综上所述,NR4A1对NF-κB/COX-2信号通路相关蛋白表达具有负向调控作用,进而减轻大鼠深静脉血栓模型中的血栓和炎症,为临床血栓栓塞性疾病的治疗提供了新的思路和策略。