lncRNA作为鼻咽癌诊断、治疗、预后标志物的研究进展*

戴婷婷,贾保昌,孙洁璇 综述,高 卓△审校

1.哈尔滨医科大学附属第四医院检验科,黑龙江哈尔滨 150001;2.广州医科大学附属肿瘤医院放疗科,广东广州 510095

鼻咽癌是一种起源于鼻咽黏膜的恶性上皮性肿瘤,77.0%以上新发病例主要集中于东亚和东南亚地区[1]。由于鼻咽癌是从鼻咽侧壁咽鼓管口周围的上皮衬里发展,靠近头骨,早期不易诊断[2]。超过70.0%患者就诊时已处于晚期,给治疗带来困难,而晚期局部复发和颈部淋巴结转移是鼻咽癌患者长期生存的主要障碍。目前,鼻咽癌的影像学方法包括磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)和18F-FDG-PET/CT,虽然18F-FDG-PET/CT可使淋巴结转移的检出率达到77.0%～88.1%,但费用昂贵[3]。血浆EB病毒(EBV) DNA检测虽然对鼻咽癌筛查的特异度为98.6%,灵敏度为97.1%[4],但鼻咽癌中EBV DNA病毒载量的水平差异很大,定量分析缺乏标准化,且对未有EBV感染的鼻咽癌患者不适用。鼻咽癌的标准治疗是同步放疗,虽然患者病情得到缓解,但用量过多会导致毒性反应,影响患者生活质量。而传统的肿瘤淋巴结转移(TNM)分期系统为最常用的预后预测指标,但它基于解剖学分析,缺乏异质性。因此,探寻有效的诊断标志物对鼻咽癌患者的诊断、治疗和预后至关重要。

有研究发现,长链非编码RNA(lncRNA)在胚胎发生、等位基因表达、干细胞多能性、蛋白质编码基因调节、细胞凋亡、周期控制、分化、生长和衰老中发挥调节作用,几乎参与整个生命过程[5]。因此,lncRNA与鼻咽癌有显著的相关性,通过异常调控参与鼻咽癌过程的基因,与鼻咽癌的发生、治疗和预后密切相关。

1 lncRNA与鼻咽癌

lncRNA最初是通过对小鼠全长cDNA文库进行大规模测序发现的[6]。lncRNA功能取决于独特的亚细胞定位,核定位的lncRNA通过招募染色质修饰复合物、染色质重构、形成R环结构招募转录因子或将lncRNA和相关效应蛋白锚定在基因启动子上的DNA-RNA三联体来调节局部基因的表达。而输出到细胞质中的lncRNA,分布至不同的细胞器,如线粒体和核糖体,从而调节信使RNA(mRNA)稳定性、干扰蛋白质翻译后修饰,导致信号转导异常[7]。

在鼻咽癌中,lncRNA一方面主要通过表观遗传调控失调、干扰信号转导通路、部分致癌转录因子的转录激活,作为竞争性内源性RNA与微小RNA结合参与鼻咽癌的癌变、上皮间充质转化和血管生成等恶性表型及介导放化疗耐药性[8]。另一方面,lncRNA调控发生在特定的细胞类型、特定的组织和特定的发育阶段,具有高特异度,还具有高效率和较高的稳定性,能通过定量聚合酶链反应(qPCR)对其丰度进行量化。lncRNA有潜力作为鼻咽癌诊断、预测和监测的生物标志物。因此,学者们利用基因芯片、下一代测序、微阵列技术、RNA测序等技术构建了lncRNA在鼻咽癌诊断、治疗和预后方面的表达谱,更多的lncRNA在鼻咽癌中被挖掘,拓宽了鼻咽癌的lncRNA图谱,为识别鼻咽癌潜在生物标志物提供重要资源。例如,FAN等[9]通过基因芯片构建10个鼻咽癌组织和6个对照的lncRNA表达谱,鉴定了1 276个lncRNA,同时构建了lncRNA-mRNA共表达模块,而利用该模块识别出的新lncRNA可能作为鼻咽癌诊疗的生物标志物和治疗靶点。

2 lncRNA与鼻咽癌的诊断

lncRNA水平的波动一定程度上反映了癌症的发生,能够对患者与非患者进行区分。lncRNA LINC00312在区分鼻咽癌患者与非肿瘤患者时,灵敏度为72.1%,特异度为87.7%,提示lncRNA LINC00312可作为诊断鼻咽癌的潜在生物标志物[10],有研究进一步发现LINC00312 rs12497104 GA基因型携带者患鼻咽癌风险高于其他人群,且G转换成A干扰了miR-411-3P和LINC00312之间的结合而导致它在鼻咽癌组织中的差异表达和鼻咽癌风险显著增加[11]。lncRNA单核苷酸多态性(SNP)参与鼻咽癌的发病也为lncRNA在疾病中的作用研究提供了一个新视角。在前期研究中,lncRNA作为鼻咽癌诊断标志物的研究主要以组织表达差异为基础,而与实体肿瘤组织相比,存在于血清、血浆等体液中的循环lncRNA也在临床诊断中发挥重要作用,无疑也是一种理想的无创诊断标志物。

HE等[12]首次发现3种血清游离lncRNA(MALAT1、AFAP1-AS1、AL359062)对鼻咽癌的联合诊断价值明显[曲线下面积(AUC)为0.918],且治疗后,这3种lncRNA的血清水平明显下降。ZHONG等[13]报道lncRNA FOXP4-AS1作为一种竞争性内源性RNA(ceRNA),通过与miR-423-5p相互作用上调STMN1蛋白,促进鼻咽癌的发生与发展,为鼻咽癌提供了新的诊断生物标志物。YAO等[14]的一项研究进一步发现血清lncRNA FOXP4-AS1诊断鼻咽癌的AUC为0.797 4,同时,FOXP4-AS1与T分期、淋巴结转移和临床分期也相关。这也暗示了lncRNA FOXP4-AS1在预后中的潜在价值。另外,FAN等[15]检测176例鼻咽癌患者的结果表明血清lncRNA对诊断鼻咽癌有较高的准确性,有助于鼻咽癌的早期诊断,不同lncRNA组合也会提高诊断的准确性。

大多数循环lncRNA主要是来源于血清、血浆,而其他来源的lncRNA尚未详细研究。但是,D′AMBROSI等[16]的研究揭示了肿瘤血小板(TEP)RNA图谱的改变是早期诊断潜在肿瘤生物标志物的新来源。WEI等[17]评估了TEP-lncRNA-ROR对鼻咽癌的诊断价值,结果发现TEP-lncRNA-ROR诊断鼻咽癌的灵敏度为60.0%,特异度为70.0%,准确性为63.9%,和EBV DNA对鼻咽癌的诊断阳性率相似(58.3%),而TEP-lncRNA ROR与EBV DNA的组合将阳性率提高到74.0%。WEI等[17]也发现lncRNA ROR在鼻咽癌患者血小板和组织中表达相反,可能是血小板通过囊泡介导的细胞间通讯或其他途径间接与鼻咽癌组织相互作用,从而导致lncRNA ROR在血小板中下调,而在组织中上调。但该研究样本量小,需扩大样本量进行进一步验证。目前,lncRNA的检测主要依赖于qPCR,当lncRNA表达丰度低时可能无法检测到,进而影响检测结果。2021年,CHEN等[18]开发了一种具有生物相容性的电化学传感器,可以提高非小细胞癌中lncRNA MALAT1的表达水平。MORLION等[19]开发了新的lncRNA捕获测序技术,可检测49 372个lncRNA的表达水平,提高了lncRNA检测的灵敏度。

3 lncRNA与鼻咽癌的治疗

放化疗耐药是阻碍鼻咽癌临床治疗的重要原因,影响治疗效果。相关研究表明lncRNA的异常表达通过特定的信号通路影响鼻咽癌细胞的辐射灵敏度,LINC00114在鼻咽癌患者血清、组织和细胞系中均表达上调,而敲低LINC00114表达来调节miR-203使ERK/JNK通路失活提高鼻咽癌细胞的辐射灵敏度[20],这提示了LINC00114可作为辐射抵抗的生物标志物。另外,lncRNA MINCR作为miR-223的内源竞争RNA(ceRNA)正向调控ZEB1,激活AKT/PI3K信号通路,降低了鼻咽癌细胞的辐射抵抗能力。有研究报道了MYC基因相关的lncRNA MINCR表达对鼻咽癌患者的放疗疗效,其特异度为71.0%,灵敏度为66.7%,AUC为0.719[21]。REN等[22]利用下一代测序技术构建了鼻咽癌紫杉醇耐药相关lncRNA的差异表达谱,当lncRNA n375709低表达时可提高鼻咽癌细胞对化疗药物紫杉醇的灵敏度。ZHU等[23]利用lncRNA微阵列技术筛选出了差异显著变化的MRVI1-AS1,发现MRVI1-AS1过表达增加了鼻咽癌细胞对紫杉醇的灵敏度。因此。在未来的研究中,通过沉默或过表达lncRNA来逆转耐药,靶向相关通路作为治疗靶点,从而达到预期的治疗效果,这为鼻咽癌化疗耐药提供了研究新方向。

lncRNA不仅可以监测鼻咽癌治疗反应,同时也是预测鼻咽癌化疗药物不良反应的独立因素。目前,减少不良反应(包括中性粒细胞减少、贫血、血小板减少、骨髓抑制)仍然是一个挑战,若能在治疗前预测药物的毒性,将减少不良反应的影响,实现降低药物毒性的治疗目标。lncRNA GAS5基因多态性rs2067079和rs6790会导致鼻咽癌患者严重的骨髓抑制和中性粒细胞减少症[24],可作为鼻咽癌患者放疗药物不良反应的预测生物标志物。WANG等[25]对505例鼻咽癌患者的研究发现,lncRNA-p53调控网络中的5个基因中有6个潜在的SNPs与放化疗药物的不良反应和疗效显著相关,从而为预测其疗效和药物毒性提供了新的生物标志物。此外,GUO等[26]利用Mass ARRAY iPLEX平台对招募的505例接受放化疗的鼻咽癌患者进行基因分型,结果表明LINC00312 rs15734 AA基因型的女性患严重白细胞减少症的风险显著增加了5.635倍,携带rs12497104 AA基因型的年轻患者发生血小板减少的风险降低90.0%。这也进一步说明了lncRNA可能作为有前景的预测化疗药物毒性的生物标志物。但由于个体差异是导致治疗不良反应不一的重要因素,所以目前关于药物毒性标志物的研究较少,主要集中于lncRNA SNPs方面。

4 lncRNA与鼻咽癌的预后

lncRNA不仅在鼻咽癌的诊断、治疗疗效方面具有较好的应用价值,同样,在鼻咽癌预后方面的价值也不容忽视。肿瘤复发和远处转移是鼻咽癌患者生存期较差的主要原因,而lncRNA表达与鼻咽癌预后和病理参数存在相关性,一定程度上对鼻咽癌的预后有指导价值。NIE等[27]研究发现lncRNA HOTAIR在N2～N3亚组中表现优于N0～N1组(AUC:0.814vs.0.688)。上皮间质转化(EMT)与癌症转移密切相关,研究发现si-SNHG12时,EMT相关标志物E-cadherin表达增强,Vimentin和N-cadherin表达降低,SNHG12高表达不仅与临床分期、分级显著相关,且与鼻咽癌患者的总生存期较短相关,可作为预测鼻咽癌患者预后的潜在生物标志物[28]。同样,lncRNA TUG1高水平也与EMT相关,且在区域淋巴结转移的鼻咽癌原发组织中表达明显高于低水平区域淋巴结转移的鼻咽癌组织(P<0.001)。以上研究说明lncRNA在鼻咽癌转移中是关键因子,是一种有前景的预后标志物。GAO等[29]报道了lncRNA在原发性和复发性鼻咽癌中有独特的表达模式,lnc-BCL2L11-3在鼻咽癌复发组织中明显升高。而lnc-AL355149.1-1和lnc-ZNF674-1在复发性鼻咽癌组织中明显减少。

但目前基于美国癌症联合委员会(AJCC)分期系统的解剖信息不足以获得准确和明确的预后,因此,需要能够反映鼻咽癌预后预测价值高的分子标志物。而鼻咽癌的特征为重度淋巴细胞浸润,研究表明肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)是鼻咽癌独立的预后因子[30]。CHEN等[31]利用单细胞RNA测序技术生成了单细胞转录组谱,建立了与鼻咽癌预后相关的免疫亚型特异性特征。虽然以上研究提示了鼻咽癌免疫细胞在预后中的作用,但缺乏lncRNA是否可作为鼻咽癌患者转移预测因子的相关报道。近期在一项多中心回顾性队列研究中,LIANG等[32]采用LASSO筛选了9个lncRNA构建了鼻咽癌转移模型,通过生存分析发现,高风险组患者5年远处转移率高达34.0%,而低风险组仅为7.0%;随后通过反转录(RT)-qPCR检测,计算队列中发现的局部晚期鼻咽癌患者的风险评分,以区分高风险和低风险患者,其中低危组患者B淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的浸润水平更高,这说明该模型对转移的预测能力与免疫异质性相关。该研究还发现构建的模型对鼻咽癌转移的预测效能优于传统的临床N分期和EBV DNA载量(0.78vs.0.65、0.61),而且与单独的N分期相比,联合模型显著提高了训练队列中预测转移的效率(AUCN分期=0.65vs.AUC联合=0.77)。这说明与肿瘤免疫异质性相关的lncRNA能够有效预测局部晚期鼻咽癌的远处转移,而且可以利用经济适用的RT-qPCR进行检测,这对指导患者个体化危险分层具有重要意义。

5 总结与展望

综上所述,鼻咽癌中存在多种与诊断、治疗和预后相关的lncRNA,通过多种途径、独特的表达模式和lncRNA基因遗传变异来影响鼻咽癌的癌变和预后判断。而沉默或过表达lncRNA可改善放化疗反应,这一发现提供了一种基于lncRNA相关基因的创新肿瘤疗法,相关的信号通路也能作为治疗靶点,能够更有效地开展个体化治疗。随着检测技术的发展,除了传统qPCR,还有新开发的具有生物相容性的电化学传感器和lncRNA捕获测序技术,这将大大提高lncRNA检测灵敏度,lncRNA是一种前景广阔的生物标志物。但lncRNA作为诊疗生物标志物仍然面临不少挑战,例如:(1)缺乏数据标准化程序,管家基因作为lncRNA分析的内部控制尚未达成全球共识。(2)缺乏大队列研究和临床试验验证lncRNA的实际价值。(3)尚未明确健康人群的特定lncRNA参考区间。而随着对lncRNA分子和结构特性了解的不断深入,技术的不断进步,相信在不久的将来,lncRNA作为生物标志物有望转化为临床应用,能够更好地实现个性化的精准治疗和更准确的风险分层。