结核分枝杆菌耐药基因突变特征及与耐药水平关系的研究*

蒋燕成,张建明,陈紫萱,张志珊

福建医科大学附属泉州第一医院检验科,福建泉州 362000

结核病仍然是世界最致命的传染病杀手之一。每天约有4 100人死于结核病,有近2.8万人感染这种可预防且可治愈的疾病。自2000年以来,全球结核病的防治工作已经挽救了约6 600万人的生命。然而,前几年新型冠状病毒感染(COVID-19)大流行使多年来在终止结核病方面取得的进展出现了倒退。2020年,因结核病死亡的人数10年来第一次出现了增加。我国2020年估算的结核病新发患者数为84.2万(2019年为83.3万),估算结核病发病率为59/10万(2019年为58/10万),在30个结核病高负担国家中我国估算结核病发病数排第2位(8.5%)[1]。耐多药结核病(MDR-TB)的出现及持续蔓延,已经成为有效控制结核病的严重威胁,因此控制MDR-TB是一个迫切需要关注的问题。MDR-TB的出现和传播主要是由于DOTS策略实施不当、抗结核药物短缺或质量差、患者对处方方案治疗依从性差[2]。世界卫生组织建议对所有疑似结核病患者进行标准治疗前都应进行结核药敏试验,以避免获得性耐药的进一步产生[3]。本研究对结核分枝杆菌(MTB)的耐药基因变特征,以及其突变特征与耐药水平相关性来进行分析,以了解MTB的耐药机制,尽早尽快地为临床感染患者治疗提供基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年6月至2021年6月在泉州市第一医院检验科经结核药敏试验鉴定为耐利福平、异烟肼的MTB 51株作为研究对象。

1.2仪器与和试剂 Extractor 36 核酸快速提取仪,晶芯®SlideWasherTM洗干仪,晶芯®微阵列芯片扫描仪及MTB耐药基因检测试剂盒均购自北京博奥晶典生物科技有限公司。PCR仪和Sensititre®结核药敏板购自美国赛默飞世尔科技有限公司。MGIT 7 mL培养管、BACTEC MGIT 960系统、MGIT 960SIRE药敏试剂盒均购自美国BD公司。

1.3方法

1.3.1DNA微阵列芯片法 (1)DNA提取:向核酸提取管中加入50 μL核酸提取液,取混匀的菌液标本(以1个麦氏浊度为宜)20 μL加到核酸提取液中。将核酸提取管置于核酸快速提取仪中,最大转速振荡5 min。将核酸提取管置于95 ℃水浴锅或金属浴中,加热5 mim。1 000r/min离心1 min,备用。(2)PCR扩增:根据被测样品准备200 μL离心管,并预先标记样品编号。从试剂盒中取出PCR扩增试剂使其充分融化,轻摇混匀。将PCR扩增试剂按每管18 μL分装于200 μL离心管中,盖好管盖。在标本制备区内加入模板DNA。模板DNA包括被测样品DNA(核酸提取管中的上清液)、阳性对照品或阴性对照品。对于1个样品,向3管中分别加入同一模板DNA各20 μL。扩增条件设定:37 ℃ 600 s,94 ℃ 600 s,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共35个循环;94 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共10个循环;72 ℃ 420 s。(3)芯片杂交:将扩增好的产物置于扩增仪中95 ℃变性5 min,冰浴5 min,取出杂交缓冲液按9 μL杂交缓冲液,相应向每管中分别加入同一样品的PCR产物1和PCR产物2各3 μL,PCR产物1和PCR产物3各3 μL。在基因微阵列芯片杂交盒的底部加入200 μL蒸馏水。经盖片的加样孔加入13.5 μL杂交反应混合物,迅速盖上杂交盒并密封。立即将密封好的杂交盒水平加入50 ℃预热的恒温水浴锅中,待杂交盒全部放入后计时120 min。杂交反应结束后,将杂交盒水平取出并将芯片取出,再进行芯片的洗涤,洗液Ⅰ洗1次,30 ℃,120 s;洗液Ⅱ洗2次,30 ℃,60 s。然后离心机中离心5 min,甩干。打开TBMDRTest软件预热10 min,将芯片放置扫描仪芯片卡槽中,开始扫描芯片,进行结果的判读。

1.3.2最低抑菌浓度(MIC)药敏试验法 使用Sensititre MYCOTBI MIC法进行MIC测定试验。每个测试批次中均包含作为对照的MTB H37Rv菌株(ATCC 27294)。分别依据1.0 μg/mL和0.5 μg/mL的临界水平对MTB的耐药性进行判读,其中MIC≥4 μg/mL为高耐药,MIC<4 μg/mL为低耐药。

1.3.3比例法 采用药敏试验对痰标本进行4% NaOH/NaCl前处理后接种至液体培养管中,随后置于MGIT960培养仪中培养。药敏试验严格按照美国BD公司MGIT960系统的操作步骤对其进行异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇4种一线抗结核药物检测,培养管内药物终水平分别为0.1、1.0、1.0、5.0 μg/mL。

1.4统计学处理 采用Excel 2007进行数据录入整理,使用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计数资料以例数或百分比表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1表型检测和MIC测定结果 51株耐药MTB菌株中,有1株耐利福平单耐药MTB,2株耐异烟肼单耐药MTB,48株耐利福平、异烟肼耐多药MTB。通过对23株耐多药MTB菌株进行MIC药敏试验发现:对利福平而言,MIC>16 μg/mL有21株(91.30%),MIC=16 μg/mL有1株(4.35%),MIC=2 μg/mL有1株(4.35%),不同MIC耐多药MTB菌株对利福平耐药的构成比比较,差异有统计学意义(χ2=52.17,P<0.05);对异烟肼而言,MIC>4 μg/mL有10株(43.48%),MIC=4 μg/mL有7株(30.43%),MIC=2 μg/mL有1株(4.35%),MIC=1 μg/mL有2株(8.70%),MIC=0.25 μg/mL有2株(8.70%),MIC=0.12 μg/mL有1株(4.35%),不同MIC耐多药MTB菌株对异烟肼耐药的构成比比较,差异有统计学意义(χ2=6.72,P<0.05)。

2.2DNA微阵列基因芯片法结果 通过DNA微阵列芯片法对48株耐多药MTB进行基因型检测,结果显示:对利福平rpoB基因而言,有6株为野生型(12.5%),点突变以531(C→T)突变型为主,有30株(62.5%),其余分别为516(A→T)突变型4株(8.3%)、526(C→T)突变型3株(6.3%)、526(C→G)突变型3株(6.3%)、533(T→C)和516(A→T)双突变1株(2.1%),有1株出现了样本异常,利福平rpoB基因不同突变型菌株的构成比比较,差异有统计学意义(χ2=52.84,P<0.05);对异烟肼katG、inhA基因而言,有14株野生型(29.2%),点突变以315(G→C)突变型为主,有25株(52.1%),其余分别为315(G→A)突变型3株(6.3%)、-15(C→T)突变型5株(10.4%)、315(G→C)和-15(C→T)双突变型1株(2.1%),异烟肼katG、inhA基因不同突变型菌株的构成比比较,差异有统计学意义(χ2=34.12,P<0.05)。

2.3不同检测法方法对MDR-TB检测结果的比较 通过比例法、MIC法、基因芯片法对23例耐多药MTB进行耐药情况检测显示,3种方法检测出的耐药菌株均以耐利福平、异烟肼同时耐药为主,但3种方法耐利福平、异烟肼菌株检出率比较,差异无统计学意义(χ2=4.13,P>0.05)。见表1。

表1 比例法、MIC法、基因芯片法对MDR-TB检测结果比较[n(%)]

2.4利福平耐药基因突变类型在不同MIC的分布情况 88.9%的531(C→T)突变菌株MIC>16 μg/mL,5.6%的菌株MIC=16 μg/mL,5.6%的菌株MIC=2 μg/mL;4株526(C→T)突变型和1株516(A→T)突变型菌株的MIC均>16 μg/mL。见表2。

表2 利福平耐药基因突变类型与MIC的关系[n(%)]

2.5异烟肼耐药基因突变类型在不同MIC的分布情况 66.7%的野生型突变菌株MIC>4 μg/mL,33.3%的野生型突变菌株MIC=0.12 μg/mL;2株315(G→A)突变型菌株MIC=0.25 μg/mL,MIC=1 μg/mL和MIC>4 μg/mL的315(G→A)突变型菌株各1株;MIC≥4 μg/mL的315(G→C)突变菌株12株,1株315(G→C)突变菌株的MIC=1 μg/mL;1株-15(C→T)突变型菌株MIC=2 μg/mL,1株-15(C→T)突变型菌株MIC>4 μg/mL;1株315(G→C)和-15(C→T)双突变型菌株MIC=4 μg/mL。见表3。

表3 异烟肼耐药基因突变类型与MIC的关系[n(%)]

3 讨 论

目前对于MTB耐药的检测主要有2种方法,其中一种为表型检测,另外一种为基因型检测。对MTB来说,抗生素的临界水平或“断点”指的是能够抑制95%尚未接触过任何抗菌药物(“野生型”)的菌株的最低水平,通常代表最高的MIC,或者是用尚未接触过药物的野生型菌株所获得的抑制生物体生长所需的抗生素的浓度。由于发现耐多药MTB对相应的药物有着不同的耐药程度[4],笔者将收集到的耐多药MTB进行MIC测定,其目的是分析耐多药MTB的不同基因突变特征,以及MIC的变化情况。基因芯片技术由于其灵敏度和效率高,可作为传统药敏试验的一种补充手段,尤其是对利福平和异烟肼耐药菌株的检测,从而有助于在临床上如何制订、实施有针对性的个体化治疗和用药方案[5]。比例法是目前大多医院在使用的检测MTB耐药性的主要方法,但其检验周期较长,得到较纯的培养物后还需要4周的时间才能得到结果,并且其较多的影响因素,烦琐的操作步骤,易受干扰[6]。

本研究采用Sensititre MYCOTBI MIC法和DNA微阵列基因芯片法与比例法进行比对,结果显示MIC法与比例法的符合率为95.7%,这与RICHTERA等[6]关于MIC法的研究一致。MIC法能较准确检测出一线、二线抗结核药物真实的MIC,且检测周期较比例法短,有利于尽早为临床医生提供耐药情况以便临床治疗。比例法和基因芯片法的符合率为87.0%,这与李丹等[7]关于基因芯片技术在分枝杆菌菌种鉴定和耐药性分析中应用的研究一致。DNA微阵列基因芯片法检验周期短,高速,可靠,有利于耐药结核分枝杆菌的早期检测。

本研究结果表明,88.9%的531(C→T)耐利福平突变菌株中MIC>16 μg/mL,5.6%的531(C→T)耐利福平突变菌株MIC=16 μg/mL,5.6%的531(C→T)耐利福平突变菌株MIC=2 μg/mL,4株526(C→T)突变型和1株516(A→T)突变型均MIC>16,但由于所收集到的菌株数不足,未能发现密码子511和533相关的MIC。有研究表明,密码子531、516、526是可能导致MTB对利福平产生高耐药水平的常见突变类型,511和533密码子有可能会产生对利福平的低耐药水平[8]。对代谢活跃的MTB,利福平具有显著的杀菌作用。利福平是靶向DNA依赖性RNA聚合酶并抑制该菌转录的药物,细菌RNA聚合酶基因的81碱基对区域中的突变rpoB(密码子507～533)编码酶的活性位点,其对所有利福平耐药菌株的比例>95%[9]。本研究结果发现,对利福平rpoB基因而言,最常见的突变类型是531(C→T)突变型,其次是516(A→T)、526(C→T)、526(C→G)突变型。有研究显示,在墨西哥常见的531(C→T)突变型是在RRDR中观察到的最常见的突变[10]。ZAW等[11]的研究中指出,rpoB 531(C→T)是最常见的单核苷酸多态性(SNP),而密码子526的突变是第2常见的SNP,即使在同一个国家,与耐利福平相关的rpoB基因突变也有很大差异。

耐多药MTB中在DNA微阵列基因芯片中对关于异烟肼耐药的katG和inhA基因中检测,katG具有2 223 bp的长度并且合成参与霉菌酸合成的过氧化氢酶,katG基因中最普遍的突变是在密码子315(Ser315→Thr;S315T)处的取代,发现其在40%～90%的耐异烟肼临床MTB分离株中发生,因此被认为是可靠的检测标记[12]。而inhA是FAS-Ⅱ系统的烯酰基-酰基载体蛋白(ACP)还原酶,其催化在与ACP相关的生长脂肪酸链的第二位双键NADH依赖性还原,由于异烟肼在治疗结核病患者方面的成功,inhA是临床验证的目标[13],试验结果发现其主要的突变类型是315(G→C)突变型,然后是-15(C→T)突变型,其次是315(G→A)突变型,还有部分的315(G→C)和-15(C→T)双突变型。50%～95%的耐异烟肼株中存在katG基因位点的第315密码子突变,20%和35%的耐异烟肼株中存在着inhA调控区的突变。最常见的inhA突变发生在C15T位点,是在其的启动子区,这一般与耐药的单抗有关。inhA编码区突变的菌株通常表现为对异烟肼的低水平耐药。

本研究结果显示,密码子531、516、526可能是导致MTB对利福平产生高耐药性的常见突变类型。katG315与异烟肼的高耐药性相关,而inhA则较多与异烟肼的低耐药性相关。利福平rpoB中最常见的突变类型是531(C→T)突变型,异烟肼中最常见的是katG315(G→C),其次是inhA-15(C→T)。本研究通过分析耐药基因突变位点在不同药物MIC的分布情况,快速获得耐药水平,有助于制订治疗方案和阐明耐药机制,指导临床用药。