基于网络药理学及分子对接技术探讨归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的作用机制

叶书含 赵润元 廖永州

(1 广州中医药大学第一临床医学院,广东省广州市 510405;2 广州中医药大学第一附属医院儿科,广东省广州市 510405)

儿童过敏性紫癜是一种小儿常见疾病,是由IgA介导的系统性血管炎,多累及毛细血管、小动静脉,主要表现为皮肤紫癜,常并发关节疼痛、消化道出血及肾炎等。目前儿童过敏性紫癜没有特异性的治疗方案,常使用激素及免疫抑制剂进行治疗,但尚无研究表明激素及免疫抑制剂能明显改善过敏性紫癜患儿的预后[1]。归脾汤是临床上治疗过敏性紫癜的常用方剂,多项临床研究表明归脾汤治疗过敏性紫癜的临床效果良好[2-4]。网络药理学是近年来用于中医药方剂机制研究的热门方法学,其通过构建“药物-成分-靶点-疾病”多层次网络,更加全面系统地分析中医药治疗疾病的分子机制,与中医药多成分、多靶点的特点相符。本研究基于网络药理学和分子对接技术,探究归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的作用机制。

1 资料与方法

1.1 归脾汤活性成分及其作用靶点的筛选 在BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)检索归脾汤中12味中药(白术、当归、茯苓、黄芪、龙眼肉、远志、酸枣仁、人参、木香、甘草、生姜、大枣)的活性成分,检索式为“BAIZHU”“DANGGUI”“FULING”“HUANGQI”“LONGYANROU”“YUANZHI”“SUANZAOREN”“RENSHEN”“MUXIANG”“GANCAO”“SHENGJIANG”“DAZAO”,设置筛选条件为匹配分值>20分、P≤0.05,然后使用BATMAN-TCM数据库内置的分子匹配系统检索活性成分的作用靶点。

1.2 归脾汤治疗儿童过敏性紫癜相关靶点的获取 以“anaphylactoid purpura”作为检索式,在GeneCards®数据库(https://www.genecards.org/)中检索儿童过敏性紫癜相关靶点,检索时间为2018—2023年。将归脾汤活性成分的作用靶点与儿童过敏性紫癜相关靶点上传至OmicShare云平台(https://www.omicshare.com/tools/)制作韦恩图,从而获得交集靶点,即归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的相关靶点。

1.3 归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的“成分-靶点”网络的构建 根据归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的相关靶点,找出对应的活性成分,使用Cytoscape 3.5.3软件构建归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的“成分-靶点”网络,并使用网络分析模块对构建的网络进行拓扑参数分析,按照度值由大到小进行排列,选取排名前10的活性成分作为主要活性成分,通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查询主要活性成分的分子结构式。

1.4 蛋白-蛋白相互作用网络的构建及核心靶点的提取 将归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的相关靶点导入STRING数据库(https://string-db.org),设定物种为人类,对相关靶点进行分析获得相关靶点的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)数据,将数据导入Cytoscape 3.5.3软件制作PPI网络。使用Cytoscape 3.5.3软件内置的网络分析模块对PPI网络进行拓扑参数分析,选取度值大于2倍中位数的靶点作为归脾汤治疗过敏性紫癜的核心靶点。

1.5 核对靶点的富集分析 将核心靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/),通过功能分析模块进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析项目包括 3 个类别,即细胞组分、分子功能、生物过程,依据富集基因数目由大到小进行排序,选取前20个条目,并排除与细胞内特异性代谢相关的条目,整理后通过OmicShare云平台的GO功能富集分析模块进行可视化处理。将KEGG通路富集分析结果依据富集基因数目由大到小进行排序,选取前20条通路,并排除寄生虫及癌症等相关通路,整理后通过OmicShare云平台的富集分析高级气泡功能构建高级气泡图。

1.6 分子对接分析 利用归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的“成分-靶点”网络反向找出核心靶点对应的活性成分,在PDB数据库(https://www.rcsb.org)中获取核心靶点和活性成分的结构,使用AutoDock Tools 1.5.6软件进行去水、加氢、分离配体等处理后,使用AutoDock Vina软件进行分子对接分析,结合能<-5 kal/mol则提示结合有意义。

2 结 果

2.1 归脾汤的活性成分及其作用靶点 白术的活性成分5个,作用靶点56个;当归的活性成分73个,作用靶点1 186个;茯苓的活性成分18个,作用靶点515个;黄芪的活性成分17个,作用靶点354个;龙眼肉的活性成分3个,作用靶点301个;远志的活性成分6个,作用靶点173个;酸枣仁的活性成分23个,作用靶点575个;人参的活性成分109个,作用靶点1 334个;木香的活性成分50个,作用靶点1 192个;甘草的活性成分49个,作用靶点279个;生姜的活性成分95个,作用靶点1 306个;大枣的活性成分33个,作用靶点740个。汇总后删除重复的活性成分和作用靶点,共获得活性成分411个,作用靶点2 193个。

2.2 归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的相关靶点 共获得儿童过敏性紫癜相关靶点715个,与归脾汤活性成分的作用靶点取交集,共获得223个交集靶点。见图1。

图1 韦恩图

图2 归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的“成分-靶点”网络

2.3 归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的“成分-靶点”网络 223个交集靶点共对应230个活性成分,使用Cytoscape 3.5.3软件构建“成分-靶点”网络,见图 2。将度值由大到小进行排序,选取排名前10的活性成分作为主要活性成分,分别为桦木醇、β-紫罗兰酮、(E)9-异丙基-6-甲基-5,9-癸二烯-2-酮、青蒿酮、豆甾醇、肉豆蔻醇、腺苷三磷酸、1-甲基-2-十二烷基-4(1H)-喹诺酮、苯乙酸、棕榈酸,将活性成分上传至 PubChem 数据库,获取分子结构式,见图3。

图3 主要活性成分的分子结构式

2.4 PPI网络及核心靶点 构建归脾汤治疗儿童过敏性紫癜相关靶点的PPI网络后进行拓扑参数分析,共筛选出归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的核心靶点35个。见表1。

表1 核心靶点的度值

2.5 核心靶点的GO功能富集分析结果 GO功能富集分析结果显示,核心靶点涉及6种细胞组分,主要与溶酶体和滤泡的生成有关;涉及7个生物过程,主要与炎症反应、免疫应答、内皮的保护有关;涉及7种分子功能,主要与各种激酶的活性代谢及血小板的活性有关。见图4和表2。

图4 GO功能富集分析圈图

2.6 核心靶点的KEGG通路富集分析结果 依据富集基因数目由大到小进行排序,选取前20条通路,并排除与癌症、寄生虫等相关的信号通路,最终获得17条信号通路,包括TNF信号通路、Janus激酶(Janus kinase,JAK)/STAT信号通路、TLR信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/AKT信号通路、叉头框蛋白O3(forkhead box O3,FOXO3)信号通路、MAPK信号通路、Erb-B2受体酪氨酸激酶2(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2,ErbB)信号通路、MTOR信号通路、造血细胞系、NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)信号通路、TGF-β信号通路、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路、B淋巴细胞受体信号通路、白细胞跨内皮迁移、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信号通路、细胞凋亡、幽门螺杆菌感染相关的上皮细胞信号通路,见图5。

图5 KEGG通路富集分析高级气泡图

2.7 分子对接分析结果 根据核心靶点的筛选结果和富集分析结果可知,归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的核心靶点及其涉及的信号通路主要集中在炎症及免疫反应方面。其中TGF-β1是抑制炎症及免疫反应的重要靶点,且在T淋巴细胞向调节性T淋巴细胞(regulatory T lymphocyte,Treg)分化过程中起着关键作用[5]。因此,本研究选择TGF-β1进行分子对接分析,利用“成分-靶点”网络反向找出TGF-β1对应的活性成分并逐一进行分子对接。结果显示,共有11个活性成分的结合能<-5 kcal/mol,主要包括榆耳三醇、苍术醇等,见表3和图6。

表3 TGF-β1的分子对接分析结果

图6 结合能最高的两个活性成分的分子对接图

3 讨 论

儿童过敏性紫癜的病理基础为血管炎,是一种自身免疫性血管炎症疾病。体液免疫异常是儿童过敏性紫癜发病的主要机制,其中IgA起着重要作用。细胞免疫异常也是儿童过敏性紫癜的发病机制之一,特别是T淋巴细胞免疫异常。此外,凝血机制、炎症因子等因素在其免疫学发病机制中也起着重要的作用[6-7]。归脾汤由白术、当归、茯苓、黄芪、龙眼肉、远志、酸枣仁、人参、木香、甘草、生姜、大枣组成,活性成分主要包括桦木醇、β-紫罗兰酮、肉豆蔻醇、豆甾醇、腺苷三磷酸、苯乙酸、棕榈酸等。其中桦木醇、肉豆蔻醇、腺苷三磷酸可以通过调节免疫细胞的凋亡及细胞因子的分泌来发挥调节免疫功能的作用[8-10],β-紫罗兰酮、豆甾醇可以通过调控PI3K/AKT等信号通路来调节炎症反应[10-12]。

本研究结果显示,归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的核心靶点主要与免疫反应和炎症反应有关,包括TGF-β1、IL-6、TNF、IL-17A、FOXP3等。其中TGF-β1是重要的抑炎因子,而TNF是重要的炎症介质,二者表达失衡是导致儿童过敏性紫癜发病的重要因素[13]。此外,上述靶点均与Th17/Treg比例失衡相关[14-15],而Th17/Treg比例失衡引起的免疫功能亢进是导致儿童过敏性紫癜发生的重要因素[16]。研究显示,在只有TGF-β1存在的情况下, FOXP3可诱导CD4+T淋巴细胞分化为Treg[17]。IL-17A可促进IL-6分泌,而IL-6又可以通过STAT3促使CD4+T淋巴细胞分化为Th17,并能抑制FOXP3的表达,从而抑制CD4+T淋巴细胞向Treg分化,引起Th17/Treg比例失衡,导致免疫功能失调,引发儿童过敏性紫癜[18-20]。

本研究的GO功能富集分析结果提示,核心靶点涉及的生物过程主要集中在炎症反应、免疫应答、内皮的保护等方面,涉及的细胞组分主要与溶酶体和滤泡的生成有关,而涉及的分子功能主要与各种激酶的活性代谢和血小板的活性有关,提示归脾汤可能通过调控炎症因子分泌、调节血小板功能和保护血管内皮细胞来治疗儿童过敏性紫癜。KEGG通路富集分析结果显示,核心靶点涉及的主要信号通路包括TLR信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路、JAK/STAT信号通路、PI3K/AKT 信号通路。TLR/NLR可以激活NF-κB、MAPK等炎症相关信号通路,刺激B淋巴细胞释放TNF-α、IL-6等细胞因子,并通过JAK/STAT通路抑制 Treg 的功能[21]。PI3K/AKT信号通路可通过抑制 TGF-β信号通路,抑制CD4+T淋巴细胞向Treg分化[22]。由此可见,归脾汤可能通过抑制上述信号通路来调节免疫平衡及炎症反应,从而发挥治疗儿童过敏性紫癜的作用。此外,归脾汤可能具有促进血小板生成及提高血小板活性的作用,能够保护血管内皮细胞,避免血管壁受到损伤,减少变态反应的发生,从而抑制儿童过敏性紫癜的发生[23]。本研究分子对接技术结果显示,有11个活性成分与TGF-β1的结合活性较好,主要包括榆耳三醇、苍术醇等,说明归脾汤主要通过这些活性成分来抑制炎症反应及促进Treg的分化,从而发挥治疗儿童过敏性紫癜的作用。

综上所述,归脾汤治疗儿童过敏性紫癜的作用机制可能与其多种活性成分调控TGF-β1、IL-6、TNF、IL-17A、FOXP3等靶点及TLR、NF-κB、MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT等信号通路,从而调节Th17/Treg平衡及抑制炎症反应有关。此外,归脾汤也可能通过调节血小板功能和保护血管内皮细胞来发挥治疗儿童过敏性紫癜的作用。