半枝莲水提液体外抑菌及抑菌稳定性研究

钱志瑶 罗永迪 李丽琼 覃容贵

[摘要] 目的 探究半枝蓮水提液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耻垢分枝杆菌的体外抑菌活性及抑菌稳定性，为临床应用及开发植源性抑菌药物提供研究基础。方法 采用纸片扩散法测定半枝莲水提液对供试菌的抑菌活性，琼脂稀释法测定其最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）；同时以抑菌圈直径为指标，探究盐浓度、紫外光照射和不同pH对半枝莲水提液抑菌稳定性的影响。结果 半枝莲水提液对4种供试菌有抑菌活性，抑菌圈直径分别为（18.27±0.25）、（18.0±0.50）、（17.7±0.26）、（18.0±0.00）mm，为高度敏感，MICs分别为5.41、6.08、6.08、5.41mg/ml。抑菌稳定性实验结果表明，盐浓度、紫外光照射、pH对半枝莲水提液体外抑菌活性均无显著影响（P>0.05），抑菌活性保留率均>95.0%。结论 半枝莲水提液对4种供试菌有良好的体外抑菌活性和抑菌稳定性。

[关键词] 半枝莲；纸片扩散法；琼脂稀释法；最小抑菌浓度；抑菌稳定性

[中图分类号] R945      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.21.015

Study on antibacterial activity and stability of Scutellaria barbata aqueous extract in vitro

QIAN Zhiyao1， LUO Yongdi1， LI Liqiong1， QIN Ronggui2

1.School of Public Health， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， Guizhou， China; 2.School of Pharmaceutical， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， Guizhou， China

[Abstract] Objective To explore the antibacterial activity and stability of Scutellaria barbata aqueous extract on Escherichia coli， Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa and Mycobacterium smegmatis in vitro. It provides the research basis for clinical application and the development of phyto-bacteriostatic drugs. Methods The antibacterial activity of Scutellaria barbata aqueous extract was determined by the disk diffusion method， and the minimum inhibitory concentration （MIC） was determined by the agar dilution method. At the same time， the diameter of the inhibition zone was taken as an indication， and the effects of salt concentration， ultraviolet irradiation and different pH on the antibacterial activity of Scutellaria barbata aqueous extract were investigated. Results The Scutellaria barbata aqueous extract had antibacterial activity against the four tested bacteria. The diameter of the inhibition zone was （18.27±0.25）， （18.0±0.50）， （17.7±0.26）， and （18.0±0.00） mm respectively， which were highly sensitive， and the MICs were 5.41， 6.08， 6.08， 5.41mg/ml respectively. The results of the bacteriostatic stability test showed， Salt concentration， UV irradiation and pH had no significant effect （P>0.05） on the external antibacterial activity of the aqueous extract， and the retention rates of antibacterial activity were greater than 95.0%. Conclusion The Scutellaria barbata aqueous extract showed good antibacterial activity and stability in vitro against the four tested bacteria.

[Key words] Scutellaria barbata; Disk diffusion; Agar dilution method; MIC; Stability

半枝莲属唇形科黄芩属多年生草木植物，其名最早见于《外科正宗》，是一种被少数民族广泛应用的清热解毒类中草药，临床上用于大肠癌、卵巢癌、食管癌等的治疗[1-2]。近年来，国内外学者对半枝莲水提物的研究越发深入，美国加州大学的一项研究报道，半枝莲水提物对早期激素敏感或晚期激素不敏感的乳腺癌、前列腺癌细胞系有抗增殖作用[3]。济南市第四人民医院美容整形烧伤外科团队利用半枝莲水提物合成一种纳米银离子，能有效抑制耐药菌株和敏感菌株生物膜的形成，并能有效对抗革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌，是有效的伤口愈合药物[4]。

抗生素的过度使用与滥用导致微生物对抗生素耐药性问题日趋严重，现已成为全球公共卫生危机，而加快新型抗菌药物的研发是解决抗生素耐药性问题的途径之一[5]。药用植物在治疗由病毒、细菌、真菌等引起的感染性疾病方面的历史源远流长，其来源广泛，具有高安全性、多靶向作用、广谱抑菌、耐药率低等优点，可减缓微生物耐药性的产生甚至消除耐药性[6]。英国南丁格尔医院公共卫生实验室的一项研究也表明，随着抗生素耐药性的持续出现，进一步探讨药用植物制剂潜在的抗菌特性，是天然新型抗菌剂的主要来源[7]。

半枝莲的临床用药以胶囊剂、片剂为主，学者们对其关注的领域主要集中在抗肿瘤方面，在抑菌活性方面的相关研究报道则相对较少。但有研究者将半枝莲水提液制备成抑菌凝胶，复配其他中药可用于久经不愈的皮肤外伤治疗，进一步拓宽其应用与研究领域，药用价值得以提高[8]。因此，半枝莲水提液作为传统中药制剂，本文对其体外抑菌作用及抑菌稳定性进行研究，以期为临床应用价值的研究及新型植源性抑菌药物的开发提供研究基础。

1  材料与方法

1.1  药材、菌株、试剂与仪器

半枝莲中药饮片购自贵阳道生健康产业药材饮片生产有限公司。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耻垢分枝杆菌购自云南登楼生物科技有限公司。营养肉汤、营养琼脂、酪蛋白琼脂（mueller-hinton，MH）培养基均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。头孢呋辛购自苏州二叶制药有限公司。盐酸、氢氧化钠、氯化钠试剂均购自上海山浦化工有限公司。GR60DA高压蒸汽灭菌器购自美国Zealway公司。WGZ-XT细菌浊度仪购自杭州齐威仪器有限公司。JB-CJ-2FC洁净工作台购自苏州佳宝净化工程设备有限公司。GHP-9160隔水式恒温培养箱购自上海齐欣科学仪器有限公司。RE-52AA旋转蒸发器购自上海亚荣生化仪器厂。

1.2  实验方法

1.2.1  样品制备  称取适量半枝莲中药饮片，加入20倍蒸馏水，浸泡30min后置电热套上加热，保持微沸30min，提取两次，滤去药渣，合并滤液置旋转蒸发仪中减压干燥成浸膏。称取适量浸膏，加蒸馏水制成适宜浓度样品溶液用于定性考察半枝莲水提液是否具有抑菌活性。

1.2.2  菌悬液制备  无菌条件下，用接种环从活化的含菌平板中挑取单个菌落接种于已灭菌的营养肉汤中，置于37℃恒温培养箱培养18h。增菌完成，无菌蒸馏水将各菌分别稀释至3×105CFU/ml，濁度仪测定。因稀释后的菌液中营养物质较少，菌体的活性逐渐降低，各稀释菌悬液控制在15min内使用。

1.2.3  体外抑菌活性测定  ①纸片扩散法测定抑菌圈：称取适宜半枝莲水提液浸膏，加蒸馏水配制成0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00g/ml各浓度试样。制直径为6mm的圆滤纸片，灭菌，烘干，备用。制直径90mm无菌MH培养基平板，备用。取浓度3×105CFU/ml菌悬液100μl于MH培养基平板上，涂布棒涂抹均匀，制成含菌平板。将灭菌圆滤纸片按“品”字形分布贴于含菌平板上，无菌蒸馏水为空白对照、头孢呋辛为阳性对照、半枝莲水提液为试样，每片圆滤纸片对应滴加20μl溶液。处理后将各平板置于恒温培养箱中37℃培养18h后观察有无抑菌圈，并用直尺测量直径大小（mm）。结果判读：纸片边缘无菌生长，形成透明的抑菌圈，则判断有抑菌活性，以抑菌圈直径大小判断药物对供试菌的敏感度高低，≥20mm为极敏、15mm≤高敏<20mm、10mm≤中敏<15mm、<10mm为低敏。重复平行三次试验。②琼脂稀释法测定最小抑菌浓度：预实验分别考察半枝莲水提液在83.33、41.67、20.83、10.42、5.21、2.60、1.30mg/ml浓度范围对4种供试菌的抑菌情况，初步确定半枝莲水提液对各菌的MIC区间10.42～5.21mg/ml。制备直径35mm含药MH培养基平板：将半枝莲水提液与MH培养基以一定比例混合，制得含药MH培养基平板，含药浓度分别为10.42、8.75、8.08、7.42、6.75、6.08、5.41、5.21mg/ml。同时设置不含药MH培养基平板为空白对照，头孢呋辛为阳性对照。用1μl定量接种环取浓度3×105CFU/ml菌悬液，于含药平板四等分区域内分别接种1点，置37℃恒温箱中培养18h。结果判读：将各平板置于暗色、无反光的表面上观察，无菌落生长的最低药物浓度判定为该药对供试菌的MIC。重复平行三次试验。

1.2.4  抑菌稳定性试验  分别以质量分数2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的氯化钠溶液为溶剂配制适宜浓度半枝莲水提液试样，考察盐浓度对试样抑菌活性的影响。将适宜浓度半枝莲水提液试样分别紫外光照射20、30、40、50和60min，考察紫外光照射对试样抑菌活性的影响。以盐酸、氢氧化钠配制pH分别为5、6、7、8、9的溶液，以此为溶剂配制不同pH适宜浓度半枝莲水提液试样，考察pH对试样抑菌活性的影响。以相应影响因素试液为溶剂空白，蒸馏水配制的样品溶液为对照，以上文“①”中所述方法测定不同因素影响下半枝莲水提液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耻垢分枝杆菌的抑菌圈大小，计算抑菌活性保留率[9]。抑菌活性保留率（%）=[1–（d0–d1）/d0]×100%；其中d0为对照抑菌圈直径，d1为试样抑菌圈直径。

1.3  统计学方法

采用GraphPad prism 9.0统计学软件对数据进行处理分析，所有数据先进行正态性和方差齐性检验，其中计量资料若符合正态分布以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；计数资料用例数（百分率）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验或秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  半枝莲水提液抑菌活性

试药纸片边缘均无细菌生长，具有明显的抑菌圈（图1）。随着半枝莲水提液浓度的增加，4种供试菌的抑菌圈直径逐渐增大，浓度为1.00～1.50g/ml时，抑菌圈直径变化趋势不明显，浓度>1.50g/ml时，抑菌圈直径有变小趋势（图2）；经单因素方差分析，不同浓度半枝莲水提液分别对4种供试菌的抑菌圈直径均有显著影响（P<0.05），综合考虑选择浓度1.00g/ml作为考察半枝莲水提液抑菌敏感度高低的作用浓度。实验结果表明，半枝莲水提液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耻垢分枝杆菌的敏感度较高，即对4种供试菌的抑菌活性较强，抑菌圈直径大小见表1。

2.2  半枝莲水提液对供试菌的MIC

药物对供试菌的MIC可作为评价抑菌药物体外抑菌活性强弱的指标，MIC值越小，表明该药物对供试菌的抑菌活性越强；半枝莲水提液对4种供试菌的MIC分别为：大肠埃希菌5.41mg/ml、金黄色葡萄球菌6.08mg/ml、铜绿假单胞菌6.08mg/ml、耻垢分枝杆菌5.41mg/ml，见表2。

2.3  半枝莲水提液的抑菌稳定性

如图3所示，与对照组相比，随着氯化钠浓度的增加，半枝莲水提液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耻垢分枝杆菌的抑菌圈直径大小改变均不明显；同时，随着紫外光照射时间的延长，各试验组抑菌圈直径基本未发生较大变化（图4），半枝莲水提液在pH 5.0～9.0范围内的抑菌圈直径变化趋势平缓（图5）。经單因素方差分析，经不同浓度氯化钠、紫外光照射、pH处理的半枝莲水提液的抑菌圈直径与对照组抑菌圈直径大小比较，差异无统计学意义（P>0.05），各处理组的抑菌活性保留率均>95.0%。结果表明，半枝莲水提液在一定盐浓度范围内，抑菌活性保持相对稳定；紫外光照射对半枝莲水提液的抑菌活性影响不大；半枝莲水提液对4种供试菌在较宽的pH范围内均有较高的抑菌活性。

3  讨论

本研究对半枝莲水提液是否具有体外抑菌活性及对其抑菌稳定性进行基础考察，实验结果表明半枝莲水提液体外抑菌效果较好。半枝莲水提液的抑菌活性随浓度的增加而增强，但在其浓度>1.50g/ml时抑菌活性有下降趋势，原因可能是药物浓度过大，溶解度达到饱和，部分药物未能溶解而影响药物在琼脂培养基中扩散所致。

MIC常作为药效活性物质体外抑菌效果的评价指标，其值越小，抑菌活性越强。据不完全统计，部分药用植物水提液对大肠埃希菌的MIC为：倒扣草125mg/ml、绿茶18.6mg/ml、桑叶150mg/ml、臭黄荆叶300mg/ml、葎草31.25mg/ml、酢浆草50mg/ml；对金黄色葡萄球菌的MIC为：绿茶9.4mg/ml、桑叶75mg/ml、臭黄荆叶300mg/ml、葎草3.91mg/ml、酢浆草6.25mg/ml、天门冬500mg/ml；对铜绿假单胞菌的MIC为：葎草125mg/ml、酢浆草25mg/ml、鱼腥草250mg/ml，其中，天门冬水提液对大肠杆菌与铜绿假单胞菌的抑菌活性不明显，同时，大蓟水提液对耻垢分枝杆菌未表现出抑菌活性，其索氏提取物和超声提取物表现出一定的抑菌活性，MIC均为8mg/ml[10-16]。本研究以琼脂稀释法探究半枝莲水提液对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌的MIC为5.41mg/ml，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的MIC为6.08mg/ml。与以上药用植物水提液相比，半枝莲水提液对4种供试菌有较强的抑菌活性 。

临床用药的安全性和有效性与药物的稳定性密切相关。中药制剂在制备与储存过程中，易受多种因素综合作用的影响，从而引起药效的降低或完全丧失甚至产生毒副作用[17]。本研究结果表明盐浓度在一定范围内对半枝莲水提液的抑菌活性影响较小，提示半枝莲水提液在一定盐浓度条件下使用仍具有较强抑菌活性。从文献中了解到，部分药用植物水提液随着溶剂pH的改变，其抑菌活性会发生变化，而半枝莲水提液在pH5～9范围内均能表现出良好的抑菌活性，提示半枝莲水提液中可能含有较为丰富的抑菌活性物质，能在不同的pH环境下发挥抑菌作用[12，18]。紫外光照射对半枝莲水提液的抑菌活性无影响，提示紫外光照射可能未对半枝莲水提液中的抑菌活性物质造成破坏。

[参考文献][1] 李娜， 王平， 孙铁锋， 等. 半枝莲化学成分、药理作用及质量控制研究进展[J]. 中国药用植物杂志， 2020， 45（21）： 5117–5128.