黄芪多糖介导Nrf2-HO-1/NQO1信号通路促进大鼠难愈创面的愈合

徐燕婷 李哲明 范丽娜

[摘要] 目的 研究黃芪多糖对创面难愈合大鼠创面的促愈合作用及对核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）-血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）/NADPH醌氧化还原酶1（NADPH quinone oxidoreductase 1，NQO1）信号通路表达的影响。方法 18只SD大鼠用于构建慢性难愈合创面模型，造模成功后随机分为模型组、黄芪多糖组、京万红软膏组，另6只大鼠纳入空白对照组，药物涂抹创面21d，期间分析大鼠创面愈合情况。苏木精-伊红染色观察各组大鼠创面组织病理变化情况，全自动生化仪检测血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6水平；蛋白质免疫印迹（Western blot）检测大鼠创面组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平。结果 与空白对照组比较，模型组大鼠的创面组织病理改变明显，血清SOD、GSH-Px活性下降，而MDA、TNF-α、IL-1β及IL-6水平上升（P<0.01），Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达水平升高（P<0.05）。与模型组相比，黄芪多糖组和京万红软膏组大鼠治疗第7、14、21d的创面愈合率均显著提高，创面组织病理改变均明显减轻，血清SOD与GSH-Px活性均提高，而MDA、TNF-α、IL-1β及IL-6水平均下降（P<0.01），Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达水平均升高（P<0.05）。结论 黄芪多糖可通过抑制氧化应激及炎症反应促进大鼠难愈创面的愈合，并进一步激活组织Nrf2-HO-1/NQO1信号通路表达。

[关键词] 黄芪多糖；氧化应激；炎症；Nrf2-HO-1/NQO1信号通路

[中图分类号] R96      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.21.009

Astragalus polysaccharide mediates Nrf2-HO-1/NQO1 signaling pathway to promote the healing of refractory wounds in rats

XU Yanting1， LI Zheming2， FAN Lina3

1.Department of Pharmacy， Hangzhou Fuyang Traditional Chinese Medicine Orthopedic Hospital， Hangzhou 311400， Zhejiang， China; 2.Pharmacy School of Hangzhou Medical College， Hangzhou 310050， Zhejiang， China; 3.Department of Dermatology， Yuhang Maternal and Child Health Hospital of Hangzhou， Hangzhou 311100， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate the healing promoting effect of astragalus polysaccharide on wound in rats with chronic wound healing and its impact on nuclear factor erythroid 2 related factor 2 （Nrf2）-heme oxygenase-1 （HO-1）/ NADPH quinone oxidoreductase 1 （NQO1） pathway. Methods 18 SD rats were used to eatablish chronic refractory wound model， then rats were randomly divided into model group， astragalus polysaccharide group， and Jingwanhong ointment group， another 6 rats were divided into blank control group， drug applied for 21 days and analyzed wound healing rates during period. Haematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological changes of the wound tissue， automatic biochemical analyzer was used to detect serum superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px） and malondialdehyde （MDA） levels， enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect serum tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL）-1β， and IL-6 levels， and Western blot was used to detect Nrf2， HO-1， NQO1 protein expression in wound tissue. Results Compared to blank control group， the pathological changes in wound tissue of model group rats were obvious， serum SOD and GSH-Px activities were decreased， the MDA， TNF-α， IL-1β and IL-6 levels were increased （P<0.01）， protein expression of Nrf2， HO-1， NQO1 were increased （P<0.05）. Compared to the model group， the healing rates of astragalus polysaccharide group and Jingwanhong ointment group were significantly increased on 7， 14， 21 days， the pathological changes of wound tissue were remarkably alleviated， serum SOD and GSH-Px activities were increased， while the levels of MDA， TNF-α， IL-1β and IL-6 decreased （P<0.01）， protein expression of Nrf2， NQO1， HO-1 were increased （P<0.05）. Conclusion Astragalus polysaccharide promoted the healing of refractory wounds in rats by inhibiting oxidative stress and inflammation， and further activated the expression of Nrf2-HO-1/NQO1 signaling pathway in tissue.

[Key words] Astragalus polysaccharide; Oxidative stress; Inflammation; Nrf2-HO-1/NQO1 signaling pathway

慢性难愈合创伤可由多种急、慢性创伤等经久不愈所致，并具有合并复杂基础疾病的特点，是临床治疗过程中急需关注的棘手难题[1-2]。目前，慢性创面的治疗方式有药物治疗、手术清创联合引流及各类细胞生长因子制剂治疗等[3-4]。慢性创面治疗所面临的长期复杂疗程和昂贵费用会对患者的生理、心理和家庭经济造成严重影响，因此寻求简单、有效的治疗药物对患者具有积极意义。

中医利用中药方剂治疗皮肤创伤由来已久，中药效用成分能通过改善创面微环境，达到祛腐生肌、促进创面愈合的效果，具有方便、有效的优点[5]。中药黄芪（Astragalus membranaceus）始载于《神农本草经》，其功效以排脓治痈为主，可用于治疗疮疡久溃[6]。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分之一，可通过降低炎症因子水平，起到改善组织损伤的作用[7-9]。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）-血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）/NADPH醌氧化还原酶1（NADPH quinone oxidoreductase 1，NQO1）信号通路可通过抗氧化应激、抑制炎症反应发挥创面的促愈合作用[10]。本研究通过建立慢性难愈合创伤大鼠模型，探究黄芪多糖对难愈创面的改善作用及对Nrf2-HO-1/NQO1信号通路的影响，现报道如下。

1  材料及方法

1.1  实验动物

SPF级SD大鼠24只，体质量（200±20）g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[动物生产许可证号SCXK（沪）2018-0008]，饲养于杭州鹰旸生物科技有限公司动物中心[动物使用许可证号SYXK（浙）2020-0024]，饲养环境室温（22±2）°C，相对湿度50%～75%。实验经杭州鹰旸生物医药研发中心实验动物伦理委员会审批通过（伦理审批号：EYOUNG-20210304-02）。

1.2  实验试剂

黄芪多糖（生产单位：上海源叶生物科技公司，生产批号：H15J52S137204，规格：25g、纯度60%），京万红软膏（批准文号：国药准字Z12020440，生产单位：天津达仁堂京万红药业，规格：50g/支），苏木精–伊红染液（生产单位：武汉塞维尔生物科技公司，生产批号：202012），BCA蛋白定量试剂盒（生产单位：北京索莱宝科技公司，生产批号：20201226），Nrf2、HO-1、NQO1（生产单位：美国Affinity抗体公司，生产批号：86e7450、24l5591、12C5034），大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6的酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（生产单位：江苏酶免公司，生产批号：202101、202103、202101）。

1.3  实验仪器

Nikon Eclipse E100型正置光学显微镜（日本尼康公司），610020-9Q型化学发光仪（上海勤翔公司），CMaxPlus酶标仪（美国MD公司），C16000型全自动生化检测仪（美国雅培公司），Image-ProPlus（IPP）6.0图像分析软件。

1.4  慢性难愈创伤大鼠造模和实验分组

24只大鼠适应性喂养一周，随机分为空白对照组、模型组、黄芪多糖组和京万红软膏组，每组6只。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，在无菌环境下剃毛，裸露脊柱两侧腰椎部位皮肤，标记1.5cm直径的造模区域。除空白对照组大鼠外，其余组大鼠根据标记部位制备直达筋膜的开放性伤口，并注射醋酸氢化可的松（6mg/100g）建立慢性难愈合创面模型[11]。

1.5  药物制备及给药

在完成造模给药前，观察造模大鼠创面伤口，对已有愈合迹象的伤口进行轻度撕裂，防止实验开始前伤口已出现愈合。根据分组对大鼠伤口涂抹药物：黄芪多糖组在创面部位涂抹0.5g黄芪多糖药物（药物成分：黄芪多糖∶凡士林∶十二烷基硫酸钠∶水=2∶60∶2∶65）；京万红软膏组在创面部位给予京万红软膏涂抹（0.6g）；模型组大鼠在创面部位涂抹等量凡士林（成分：生理盐水∶凡士林∶十二烷基硫酸钠∶水=2∶60∶2∶65）；空白对照组则在剃毛部位给予等量生理盐水涂抹。每天给药1次，连续3周。

1.6  大鼠创面愈合情况分析

给药期间于7、14、21d，用IPP 6.0图像分析软件分析大鼠的创伤面积，计算创面愈合率。

1.7  血清氧化应激指标检测

给药结束24h后，二氧化碳安樂死大鼠，采集血样分离得到血清。全自动生物化学检测仪检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.8  血清炎性细胞因子检测

取大鼠的血清，根据ELISA试剂盒说明进行操作，测定TNF-α、IL-1β与IL-6含量。

1.9  苏木精-伊红染色

切取大鼠创面组织皮肤置入4%多聚甲醛溶液中固定，在脱水、包埋、切片后用苏木精–伊红染色，脱水并用中性树脂封固后，显微镜观察组织病理改变和各类炎性细胞浸润情况。

1.10  Western blot检测蛋白表达

100mg大鼠创面组织样品，匀碎提取组织蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。经聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离目标蛋白，转膜，清洗。封闭后，加入含Nrf2、NQO1、HO-1抗体的稀释液，4℃孵育过夜。吸弃一抗，清洗，加二抗，室温下摇床振荡反应1～2 h，清洗。以β-actin蛋白为内参，用化学发光仪显影，chemi capture软件分析图像，测定各组大鼠创面组织中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达水平，实验重复3次。

1.11  统计学方法

采用SPSS 16.0软件对数据进行分析，计量资料多组间用One-way-ANOAY单因素方差分析，组间两两比较采用LSD分析。方差不齐者采用Kruskal- Wallis H检验。所有数据以均数±标准差（）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  黄芪多糖对创面难愈合大鼠创面愈合的影响

各组大鼠的创面随时间逐渐愈合，愈合率逐渐升高。在给药的7、14、21d，黄芪多糖组与京万红软膏组大鼠伤口愈合率均显著高于模型组（P<0.01），见图1。

2.2  黄芪多糖对创面难愈合大鼠氧化应激反应的影响

与空白对照组相比，模型组大鼠血清中的SOD、GSH-Px活性显著下降（P<0.01），MDA含量显著上升（P<0.01）。与模型组相比，黄芪多糖和京万红软膏组大鼠的SOD、GSH-Px活性显著上升（P<0.01），MDA含量显著降低（P<0.01），见图2。

2.3  黄芪多糖对创面难愈合大鼠创面组织病理变化的影响

空白对照组大鼠创面组织结构完整，形态正常。模型组大鼠创面组织出现红肿炎症，各类炎性细胞聚集明显（图3箭头），形成的新生肉芽组织较薄。与模型组相比，黄芪多糖组和京万红软膏组大鼠创面组织的红肿程度明显减轻，少量炎性细胞聚集（图3箭头），新生肉芽组织形成较良好，见图3。

2.4  黄芪多糖对创面难愈合大鼠炎症反应的影响

与空白对照组相比，模型组大鼠血清的TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著增加（P<0.01）；与模型组相比，黄芪多糖组与京万红软膏组大鼠血清中的TNF-α、IL-1β与IL-6含量显著降低（P<0.01），见图4。

2.5  黄芪多糖对创面难愈合大鼠创面组织中Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠创面组织中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，黄芪多糖组和京万红软膏组大鼠创面组织中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达水平显著升高（P<0.05），见图5。

3  讨论

皮肤创伤愈合是体内及组织中许多因子发生相应调节、修复损伤组织的过程[12]。损伤后创面愈合可分为止血后炎症、增殖及组织重塑三个阶段。在愈合微环境改变的过程中，损伤刺激持续存在、氧化应激及炎症反应增加均能影响创面的正常愈合，导致创面难愈[10]。炎症反应是创面损伤最重要的反应，过度炎症反应可激发细胞进入氧化应激状态，干扰创面修复[13]。

大量研究表明，中药外用制剂可通过调控细胞因子促进创面愈合[1]；黄芪多糖可通过下调重症烧伤患者全身炎性细胞因子IL-6和TNF-α水平促进创面愈合[7]。SOD、GSH-Px是存储于细胞内的内源性抗氧化酶，两者发挥清除自由基、保护组织的作用；而MDA为脂质氧化产物，在创面组织中水平增高[14-15]。本研究结果显示，黄芪多糖可显著降低MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提高创面难愈大鼠血清的SOD、GSH-Px活性，提示黄芪多糖具有抑制慢性创面难愈大鼠体内氧化应激及炎症反应的作用，同时大鼠使用黄芪多糖后的第7、14、21d创面愈合率均显著升高，损伤组织内炎性细胞浸润程度降低，新生肉芽组织增生增加，提示黄芪多糖通过抑制氧化应激和炎症反应促进大鼠难愈创面的愈合。

Nrf2的表达能促进细胞抗氧化酶的分泌及活性，且研究发现Nrf2相关通路的激活可减轻急性损伤引起的氧化应激和炎症反应[13，16-18]。研究显示Nrf2-HO-1/NQO1信号通路激活可增强糖尿病小鼠溃疡皮肤的抗氧化功能并减弱炎症反应，提示其对伤口愈合具有积极作用[19-20]。本研究結果显示，模型大鼠难愈创面组织的Nrf2-HO-1/NQO1信号通路表达上调，而黄芪多糖则能进一步促进大鼠创面组织中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达水平，推测黄芪多糖通过促进Nrf2-HO-1/NQO1信号通路相关因子的表达，抑制创面氧化应激反应，促进大鼠难愈创面的愈合。

综上所述，本研究结果显示外用黄芪多糖对创面难愈合大鼠的创面愈合起促进作用，其作用可能是通过促进Nrf2-HO-1/NQO1信号通路表达，上调氧活性、下调炎症因子水平实现。

[参考文献][1] 杨露， 张永萍， 彭丽华. 中药及其外用制剂调控细胞因子促创面愈合的研究进展[J]. 中国中药杂志， 2021， 46（20）： 5173–5184.