不同时间服用米非司酮对人绒毛组织MMPs/TIMPs表达的影响

张俊勤 李亚星 韩华

药物流产作为一种非手术终止妊娠的方法,简便、安全、高效,在临床应用广泛[1]。目前比较成熟的药物流产方案主要为米非司酮150 mg或200 mg口服,48 h后米索前列醇600 μg顿服,完全流产率>90%[2,3]。但此种方法所需时间较长,若能将两药的用药间隔时间缩短,可极大方便患者。本研究观察停经49 d以内的早孕妇女顿服米非司酮12 h、24 h、48 h后绒毛组织中基质金属蛋白酶系统(matrix metalloproteinase system,MMPs)/基质金属蛋白酶组织抑制途径因子系统(matrix metalloproteinase tissure inhibition pathway factors,T1MPs)中MMP-2、MMP-9、基质金属蛋白酶组织抑制途径因子-1(matrix tissure inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的表达,明确米非司酮对MMPs/TIMPs的具体作用,从作用机制上分析米非司酮不同作用时间对早孕绒毛组织的影响,探讨缩短其与米索前列醇用药间隔的可行性,为临床简化药物流产方案提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究经河北省人民医院医院伦理委员会批准,选择2019年9月至2021年5月我院妇科门诊自愿要求终止早期妊娠的女性,共80例。患者随机分为4组(对照组,12 h组,24 h组及48 h组),每组20例。患者均签署知情同意书。对照组年龄、停经天数、胎囊大小与与12 h组(t=0.4928、0.1063、0.4929,P=0.6250、0.9159、0.6249)、24 h组(t=0.6322、1.0431、0.8649,P=0.5311、0.3035、0.3925)、48 h组研究对象(t=0.2710、0.3594、0.1959,P=0.7879、0.7213、0.8457)差异无统计学意义,具有可比性。见表1。

表1 4组孕妇一般资料比较 n=20,

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:①年龄18～40岁;②停经<49 d,且经B超证实为宫内早孕,宫内妊娠;③胎囊直径<3 cm;④平时月经规则,半年内未服用任何激素类药物。

1.2.2 排除标准:①生殖系统炎症及肿瘤;②精神疾病,无法正常交流。

1.3 方法

1.3.1 米非司酮用药方法:米非司酮,规格:25 mg/片(浙江仙琚制药股份有限公司)。12 h组:口服米非司酮150 mg,12 h后行负压吸引术;24 h组:口服米非司酮150 mg,24 h后行负压吸引术;48 h组:口服米非司酮150 mg,48 h后行负压吸引术;对照组:未服用任何药物,直接采用常规负压吸引术终止妊娠。分别留取4组吸宫术后的新鲜绒毛组织。

1.3.2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1检测

1.3.2.1 主要试剂及仪器:兔抗人MMP-2、MMP-9、TIMP-1(武汉博士德生物技术有限公司)、SP9001试剂盒及DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。水浴箱201-0(天津泰斯特仪器有限公司),普通光学显微镜(日本Olympus光学工业株式公司),Nikon尼康全自动显微照相机(日本株式会社尼康),Motic Med 6.0数码医学图象分析系统(厦门麦克奥迪仪器仪表有限公司)。

1.3.2.2 免疫组化染色方法检测MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达情况:术中所取组织切片脱蜡至水;磷酸缓冲液(PBS)清洗;3%甲醇-双氧水孵育;枸橼酸盐微波抗原修复;10%正常山羊血清37℃下孵育10 min;滴加一抗(兔抗人MMP-2、MMP-9、TIMP-1),4℃冰箱过夜;滴加生物素标记的二抗工作液(MMP-2、MMP-9、TIMP-1为山羊抗兔IgG); DAB显色剂显色,阳性显色为棕黄色;苏木素复染,1%盐酸分化,氨水返蓝;脱水,二甲苯透明,中性树胶封片;每次染色均同步设有阳性和阴性对照。

1.3.2.3 免疫组化结果判断:细胞质或细胞膜有明显棕黄色颗粒沉着为阳性表达, Motic Med 6.0数码医学图像分析系统处理,测得阳性细胞染色的平均光密度(OD)值来表示抗原表达量。

1.4 观察指标 (1) 4组临床基本资料:包括年龄、停经天数及胎囊大小。(2) 4组绒毛组织形态学观察:分析对照组、12 h组、24 h组、48 h组绒毛组织形态学。(3)分析4组MMP-2、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的OD值差异。(4)比较4组绒毛组织MMP-2、 MMP-9、 TIMP-1、TIMP-1表达情况。

2 结果

2.1 绒毛组织形态学观察 早孕绒毛组织由外向内分别为合体滋养细胞、细胞滋养细胞及间质中心索。合体滋养细胞核大深染而不规则,游离缘呈刷毛样,细胞滋养细胞边界清晰,单核,绒毛间质疏松。3个用药组绒毛组织均出现一定程度的变性、坏死,绒毛间质扩张水肿,合体滋养细胞胞浆减少呈多空泡,核固缩,深染等退变。细胞滋养细胞正常或变化轻微:细胞界限不清,核固缩,着色不良。见图1。

对照组 12 h组 24 h组 48 h组

2.2 4组绒毛组织MMPs/TIMPs OD值比较 12 h组、24 h组、48 h组的MMP-2、MMP-9、MMP-9/TIMP-1在绒毛组织的阳性目标OD值均明显高于对照组[(12 h组vs对照组t=2.5690、20.8139、19.6514,P=0.0142、0.0000、0.0000)、(24 h组vs对照组t=2.7901、17.8057、16.5854,P=0.0082、0.0000、0.0000)、(48 h组vs对照组t=2.8076、17.6131、25.9878,P=0.0078、0.0000、0.0000)];12 h组、24 h组、48 h组之间的MMP-2、MMP-9、MMP-9/TIMP-1在绒毛组织的阳性目标OD值比较均无统计学意义[(12 h组vs 24 h组t=1.7595、0.5199、0.8165,P=0.0865、0.6061、0.4193)、(12 hvs 48 h组t=1.9417、1.7879、1.9029,P=0.0596、0.0818、0.0647)、(24 h组vs 48 h组t=0.1054、1.2117、0.6989,P=0.9166、0.2331、0.4888)];12 h组、24 h组、48 h组TIMP-1在绒毛组织的OD值均明显低于对照组(t=6.1648、6.5872、8.3553,P=0.0000、0.0000、0.0000),12 h组、24 h组、48 h组之间TIMP-1的OD值差异均无统计学意义[(12 h组vs 24 h组t=0.0000,P=1.0000)、(12 h组vs 48 h组t=1.7594,P=0.0866)、(24 h组vs 48 h组t=1.7594,P=0.0866)]。见表2。

表2 4组MMP-2、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的OD值 n=20,

2.3 4组绒毛组织MMP-2、 MMP-9、 TIMP-1表达情况 MMP-2、MMP-9、TIMP-1均为胞浆表达,在12 h组、24 h组、48 h组的MMP-2、MMP-9、TIMP-1细胞滋养细胞、合体滋养细胞胞浆内和胞膜较对照组呈强阳性表达,表现为棕黄色物质在细胞胞浆内呈网状分布,其中各用药组之间无明显差异;对照组中TIMP-1的表达高于12 h组、24 h组、48 h组,各用药组之间无明显差异。见图2。

对照组MMP-2的表达 对照组MMP-9的表达 对照组TIMP-1的表达

3 讨论

早前,有学者就曾进行缩短米非司酮与米索前列醇用药间隔的研究[4,5]。近年来,临床资料表明缩短两种药物的用药间隔在临床上具有可行性:一项回顾性队列研究表明,米非司酮-米索前列醇间隔时间<12 h组,12～24 h组,24～48 h组在服用米索前列醇后至排出妊娠产物的临床诱导时间相似(P>0.05)[6];Flynn等[7]通过对随机试验资料进行探索性二次分析表明,用药间隔时间在7～20 h完全流产率最高,达到96.6%,远高于0～6 h组及21～48 h组(P<0.01)。

米非司酮作为一种孕激素拮抗剂,可引起蜕膜绒毛组织变性坏死,诱发流产[8]。有关米非司酮的作用机制涉及到多个方面,其中,基质金属蛋白酶系统(MMPs)可通过降解细胞外基质,参与胚泡植入的生理过程,且与基质金属蛋白酶组织抑制途径因子系统(T1MPs)一起调控着滋养层细胞的浸润程度[9],妊娠早期绒毛滋养细胞可通过分泌MMP-2、MMP-9,促进胎盘滋养细胞入侵子宫内膜基质,TIMPs(如TIMP-1,TIMP-2) 能够抑制 MMPs 的产生和活性,一定程度上维持二者平衡,保证胚胎形成和妊娠维持[10]。Nissi 等[11]通过测定129例正常妊娠以及89例早期自然流产患者血清中MMPs的表达发现,MMP-2、MMP-9水平升高可能在早期自然流产中发挥作用。施林领等[12]报道了稽留流产及复发性流产的发生可能与绒毛组织中MMP-9的表达升高、MMP-9/TIMP-1的失衡有关,说明MMPs/TIMPs平衡的精准调控在正常妊娠中发挥着重要作用。另据蒋艳丽等[13-15]研究发现,MMPs蛋白表达情况与早发性子痫前期的胎盘滋养细胞侵袭有关,而MMPs高表达,可能与Wnt/β-catenin信号通路、绒毛组织中IκB蛋白降解及活化NF-κB有关,或与MMP-9表达水平下降、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3表达水平增加引起的MMPs/TIMPs失衡有关,很容易增加流产风险。

本研究发现各用药组MMP-2、MMP-9的表达及MMP-9/TIMP-1比值较对照组明显升高(P<0.05),提示米非司酮可通过提高MMP-2、MMP-9的活性,抑制TIMP-1的调节作用,打破MMPs/TIMPs平衡,滋养细胞过度浸润,子宫内膜细胞外基质降解,宫颈组织水解剥脱,诱发流产[16]。在3个用药组之间,MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达及MMP-9/TIMP-1表达并无明显差异,说明服用米非司酮后12 h对绒毛组织即发挥作用,从而达到抗早孕的目的。

综上所述,米非司酮作用后最早12 h就已对早孕绒毛组织产生影响,证明将米非司酮与米索前列醇用药间隔缩短至12 h的服用方法理论上是可行的,这极大地缩短了药物流产时间。有学者Meta分析得出结论,两种药物同时应用也能维持早期妊娠药物流产的临床效果[17];由此,我们大胆设想女性甚至可根据自己的需求在一定时间范围内自行掌握两药的时间间隔,从而接受更加便利及个体化的流产方案。