强筋合剂对骨关节炎大鼠关节炎症的影响及机制研究

刘慧 谢海霞 徐惠平 王建中

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是世界范围内最常见的慢性关节疾病，基因、性别、年龄等多种因素均会影响其发生、发展[1]，但具体病因尚不明确。OA的主要病理改变包括关节软骨组织发生退行性病变和变形、关节滑膜炎症、软骨下骨硬化及骨赘形成等，随病程进展，受累范围可逐渐发展至全关节[2]。临床治疗OA 通常采用非药物和药物联合治疗，并转向预防，长期目标为降低患病风险和减缓疾病进展[3]。非甾体抗炎药物是当前治疗和预防OA 的首选西药，但长期服用易产生胃肠道反应和心脑血管损伤，因此患者难以长期坚持[4]。中医根据“急则治其标，缓则治其本”原则，使用补肝肾气血的中药成分来强筋健骨、通络止痛[5]，具有不良反应较少、临床有效率高、见效快等优点[6]。强筋合剂为浙江中医药大学附属湖州中医院院内制剂，由已故名老中医钱世勋先生根据临床经验方汇总而来，临床用于治疗腰肌劳损，疗效良好且未见不良反应[7]，在OA 治疗上也有一定疗效。本研究建立OA大鼠模型，观察强筋合剂对OA 的影响，并探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验大鼠 Wistar 雄性大鼠（6～8 周龄，120±20 g）共36 只，购自浙江鹰旸医药研发有限公司动物中心，动物使用SYXK 许可证号：（浙）2020-0024。饲养及实验均在浙江鹰旸医药研发有限公司动物中心进行。实验方案通过浙江鹰旸医药研发有限公司实验动物伦理委员会审查通过（批准文号：ZJEY-20220124-02）。

1.1.2 主要试剂 强筋合剂（批号：浙药制Z20100176），配方：杜仲叶、续断（炒）、丹参、淫羊藿、狗脊（制）、熟地黄、五加皮、鸡血藤各50 g，白芍38 g，骨碎补25 g，以上10 味，加水1 200 mL 煎煮2 次，合并煎液浓缩至500 mL，制得成品为500 mL/瓶，使用时加蒸馏水稀释。大鼠IL-1β ELISA 检测试剂盒（批号：MM-0047R2）购自江苏酶免实业有限公司；基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-13 抗体（批号：AF5355）、环氧化酶（cyclooxygenase，COX）-2抗体（批号：AF7003）、Ⅱ型胶原蛋白（CollagenⅡ）抗体（批号：AF0135）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号：AF7021）购自美国Affinity Biosciences 公司；二奎啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（批号：pc0020）购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA 裂解液（批号：P0013D）购自碧云天生物技术有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（批号：10600023）购自美国GE Health care Life 公司；总RNA 抽提试剂（total RNA extraction reagent，Trizol）（批号：B511311）购自生工生物工程有限公司；逆转录试剂盒（批号：CW2569）购自康为世纪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制备、分组及处理 大鼠适应性喂养1 周，随机分为对照组、模型组、强筋合剂低剂量组、强筋合剂中剂量组、强筋合剂高剂量组和盐酸氨基葡萄糖组。按1∶1 体积比将10%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸配制成混合液备用。在实验第0、3、6 天，对照组大鼠膝关节腔注入0.2 mL 0.9%氯化钠溶液，其余各组大鼠膝关节腔均注入0.2 mL混合液。各组以灌胃方式给药4 周：对照组和模型组均给予0.9%氯化钠溶液10.0 mL/（kg·d），低、中、高剂量组分别给予体积分数为21.2%、43.5%、86.9%的强筋合剂10.0 mL/（kg·d），盐酸氨基葡萄糖组给予13 g/L 的盐酸氨基葡萄糖溶液10.0 mL/（kg·d）。4 周后，各组大鼠麻醉后心脏取血0.8～1.0 mL，取得的血液样本3 500 r/min 离心15 min，分离得到血清。大鼠取血后颈椎脱臼处死，解剖并迅速剥离各组大鼠双侧膝关节，打开膝关节腔解剖得到关节软骨组织。血清、膝关节和关节软骨组织于低温冰箱保存备用。

1.2.2 大鼠关节肿胀度变化的观察 观察并记录实验周期内各组大鼠关节肿胀度的变化。游标卡尺测量造模前、给药前以及给药第1、2、3、4 周各组大鼠膝关节宽度。计算关节肿胀度（mm）=各测量时膝关节宽度-造模前膝关节宽度。测量3 次，取平均值。

1.2.3 大鼠血清中IL-1β 水平检测 采用ELISA 法。取大鼠血清，根据ELISA 检测试剂盒说明书方法，使用酶标仪检测450 nm 波长下各孔的吸光值，计算各组大鼠血清中IL-1β 水平。重复6 次，取平均值。

1.2.4 大鼠软骨组织MMP-13、COX-2、Collagen Ⅱ蛋白表达的检测 采用Western blot 法。取适量大鼠软骨组织样本，剪碎后加入1 mL裂解液，混匀，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，提取组织蛋白。BCA 法检测蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。5%脱脂奶粉振荡封闭2 h，清洗3 次。PVDF 膜放入含COX-2、Collagen Ⅱ、MMP-13 等抗体的稀释液中，4 ℃摇床振荡孵育过夜。室温振荡30 min，用5%脱脂奶粉封闭。加入二抗反应液，洗膜。化学发光仪显影，Chemi capture 软件处理，以GAPDH 为内参，根据条带灰度值计算各蛋白相对表达水平。

1.2.5 大鼠软骨组织转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）mRNA 表达的检测 采用qPCR 法。取适量大鼠软骨组织，使用Trizol 提取软骨组织总RNA。室温，12 000 r/min 离心10 min。取上清液，与氯仿混匀，离心5 min。取出上清液与异丙醇混合静置15 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，弃上清液。1 mL 无水乙醇漂洗沉淀，4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，弃上清液。重复上一步操作，室温干燥10 min。按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，基因引物由生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。PCR 反应程序：95 ℃，10 min 变性；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；循环40 次。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算TGF-β1 mRNA 相对表达量。

表1 大鼠TGF-β1 引物序列

1.2.6 大鼠膝关节病理改变观察 采用HE 染色法。取各组大鼠双侧膝关节，甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋后，切成4 μm 厚切片。HE 染色后显微镜下观察、采集分析样本相关部位。按病理评分标准对各组大鼠细胞浸润、骨侵袭和滑膜侵袭等3 方面进行评分[8]：未出现细胞浸润、骨侵袭和滑膜侵袭为0分；出现轻微的细胞浸润与滑膜侵袭为1 分；出现骨侵袭为2 分；伴随骨侵袭出现较为严重的细胞浸润与滑膜侵袭为3 分；伴随骨侵袭出现极为严重的细胞浸润与滑膜侵袭为4 分。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0 统计软件。正态分布的计量资料用表示，采用Levene 法检验方差齐性，方差齐多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK 法，方差不齐采用Welch 检验，两两比较采用Dunnett 检验。采用Spearman 秩相关进行相关性分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时期各组大鼠膝关节肿胀度比较 与对照组相比，各时间点模型组大鼠的膝关节肿胀度均显著增加（均P＜0.01），提示本次实验的骨关节炎大鼠造模成功。给药第2 周，与模型组相比，强筋合剂高剂量组与盐酸氨基葡萄糖组大鼠膝关节肿胀度均显著降低（均P＜0.05）；给药第4 周，与模型组相比，强筋合剂高剂量组与盐酸氨基葡萄糖组大鼠膝关节肿胀度均显著降低（均P＜0.01）。低、中剂量强筋合剂治疗可以改善OA 大鼠膝关节肿胀度，但差异无统计学意义，见表2。

表2 不同时期各组大鼠大鼠膝关节肿胀度变化的比较（mm）

2.2 各组大鼠血清IL-1β 表达的比较 与对照组比较，模型组大鼠血清IL-1β 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，强筋合剂中、高剂量组与盐酸氨基葡萄糖组大鼠血清IL-1β 水平均显著降低（均P＜0.01），提示强筋合剂可降低OA 大鼠血清IL-1β水平，见图1。

图1 各组大鼠血清中IL-1β 水平比较

2.3 各组大鼠软骨组织MMP-13、COX-2、Collagen Ⅱ蛋白表达的比较 与对照组相比，模型组大鼠软骨组织中MMP-13、COX-2 蛋白相对表达水平均显著升高（均P＜0.01）；与模型组相比，强筋合剂中、高剂量组和盐酸氨基葡萄糖组MMP-13、COX-2 蛋白相对表达水平均显著降低（均P＜0.05）。与对照组相比，模型组Collagen Ⅱ蛋白相对表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，强筋合剂中、高剂量组和盐酸氨基葡萄糖组大鼠软骨组织的Collagen Ⅱ均显著升高（均P＜0.01），见表3、图2。

图2 各组大鼠软骨组织中MMP-13、COX-2、Collagen Ⅱ蛋白电泳图

表3 各组大鼠软骨组织中MMP-13、COX-2、Collagen Ⅱ蛋白相对表达水平的比较

2.4 各组大鼠软骨组织中TGF-β1 mRNA 表达的比较 与对照组比较，模型组、强筋合剂低、中、高剂量组和盐酸氨基葡萄糖组的大鼠软骨组织中TGF-β1 mRNA 相对表达量均显著升高（均P＜0.01）；与模型组比较，强筋合剂中、高剂量组和盐酸氨基葡萄糖组的大鼠软骨组织中TGF-β1 mRNA 相对表达量均显著降低（均P＜0.05），见图3。

图3 各组大鼠软骨组织中TGF-β1 mRNA 相对表达量比较

2.5 各组大鼠膝关节病理学变化 对照组大鼠膝关节排列规则整齐，层次清晰可见，关节面光滑；模型组大鼠膝关节面粗糙，关节软骨与钙化软骨之间的潮线区破坏严重，可见大量炎性细胞浸润，排列紊乱。强筋合剂低大鼠膝关节可见少量软骨细胞被破坏及炎性细胞浸润现象；强筋合剂中剂量组大鼠炎性细胞浸润现象少见；强筋合剂高剂量组和盐酸氨基葡萄糖组大鼠膝关节面光滑，少量骨损失，炎症浸润程度较轻，见图4。病理评分结果显示，相比对照组，模型组评分显著上升（P＜0.01）；相比模型组，强筋合剂低剂量组评分无显著变化（P＞0.05），强筋合剂中剂量、高剂量组和盐酸氨基葡萄糖组评分均显著下降（均P＜0.01），见图5。

图4 各组大鼠膝关节组织病理检查所见

图5 各组大鼠膝关节组织病理评分比较

3 讨论

以往研究表明，炎症因子及信号通路异常激活在OA 的发展中起重要作用[9]。临床分析表明，OA 患者中血清IL-1β 水平的升高常与病情的严重程度相关[10-11]，表明IL-1β 或促进OA 的发生、发展[10]。Zheng等[12]发现，OA 大鼠体内IL-1β 表达上调可刺激MMP-13 表达增强、骨胶原蛋白Ⅰ及Ⅱ含量降低。MMP-13是软骨退化进程中造成软骨细胞外基质降解的主要蛋白酶，其表达增加与关节炎的进程呈显著相关[13]。CollagenⅡ是关节软骨中的重要的成分，其含量下降与OA 的发展相关[14]。薛太阳等[15]发现抑制MMP-13 表达和促进CollagenⅡ生成可以减轻大鼠骨关节炎。

本研究发现，模型组大鼠血清IL-1β 水平显著升高，而强筋合剂中、高剂量组大鼠血清IL-1β 水平显著降低；模型组大鼠膝关节内MMP-13表达显著增加，Collagen Ⅱ显著降低，而强筋合剂中、高剂量组大鼠膝关节内MMP-13 表达显著下降，Collagen Ⅱ表达显著增加。由此表明，强筋合剂具有降低OA大鼠血清IL-1β水平，抑制MMP-13表达及促进CollagenⅡ生成的作用。

TGF-β 亚型及其受体广泛表达于软骨、骨及滑膜组织，起维持关节平衡和稳态作用[16-17]。在OA 骨关节中，TGF-β 被大量激活并诱导炎症发生，加重关节组织损伤[18]。本研究发现模型组大鼠膝关节组织内TGF-β1 mRNA 水平显著增强，而强筋合剂中、高剂量组大鼠的TGF-β1 mRNA 水平显著降低。抑制COX-2生成可以抑制体内骨质破坏，预防滑膜增生，起到软骨保护作用[19]。本研究发现COX-2 在模型组大鼠膝关节中显著增加，而在强筋合剂中、高剂量组中显著下降。以上结果均表明，强筋合剂具有减轻OA 大鼠关节组织炎症、保护软骨的作用。

强筋合剂是本院自主开发的传统中药制剂，补肾健腰、养血活络，临床疗效肯定，安全性好。近年来对该药的质量标准进行了研究与控制[20-21]，已有研究证实，强筋合剂能有效改善骨质疏松大鼠股骨形态学，增加细胞数量，提高骨小梁密度，上调碱性磷酸酶、骨钙素表达水平，且安全性较好[22]。本研究发现高剂量强筋合剂组的大鼠膝关节表面平滑可见少量骨损失，炎症浸润程度较轻。与模型组相比，强筋合剂中剂量、高剂量组大鼠膝关节组织病理评分均显著下降，提示强筋合剂有改善OA 大鼠膝关节组织作用。

综上所述，强筋合剂能够改善OA 大鼠肿胀关节，减轻组织炎症程度，其机制可能是强筋合剂通过降低血清IL-1β 水平，抑制TGF-β1、MMP-13、COX-2蛋白生成，促进胶原蛋白Ⅱ生成以达到OA 关节改善的作用。