牛病毒性腹泻的流行病学调查与防控

张红梅，袁溶英，王 峰，薛海龙，姬 阳

榆林市畜牧兽医服务中心，陕西榆林 719000

0 引言

牛病毒性腹泻（Bovine Viral Diarrhea Disease，BVD）又称为牛病毒性腹泻/黏膜病，是由牛病毒性腹泻病毒 （Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）感染牛、山羊、绵羊、鹿等多种动物而引起的直接或者间接接触性传染病，可造成呼吸系统、消化系统、生殖系统等多系统机能发病，且引起感染动物免疫抑制，诱发其他病原微生物混合或继发感染[1]。奶牛感染BVDV后可以潜伏带毒和持续性排毒，通过污染粪便、料草等多种途径传播病毒，是主要的病毒传染源。妊娠母牛可通过胎盘垂直传播胎儿，尤其在妊娠初期的120 d内病毒可穿透胎盘而感染胎儿，此外病毒也可通过精液传播[2，3]。每个生产阶段奶牛均可感染，特别是犊牛最易感染，不同生产阶段表现出多样化的临床症状，常以严重腹泻为主，发病急，潜伏期在24 h内，发病率通常不高，约为5%，但病死率为90%～100%[4]。妊娠奶牛感染后呼吸困难，体温升高，间歇性腹泻，体况消瘦，有时发生流产、死胎等繁殖障碍。

BVD于1946年由Olafsan首次在美国纽约州奶牛中检测到，分布世界各地[5]。我国最早在1980年发现BVDV，由于奶牛规模养殖发展，管理水平参差不齐，BVD在我国多地均有不同程度流行，并有不断扩大的趋势[6]，严重危害奶牛养殖业的健康发展，已成为当前我国奶牛疫病防控中主要的传染病之一。目前，榆林市奶牛场BVD流行情况还未见报道。本研究选取5 家奶牛场，采用双抗体夹心ELISA方法检测BVDV血清抗体，以期掌握该病在榆林市奶牛养殖业流行特点，为制定有效技术防控方案提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2022年4—12月在榆林市选择5 家未免疫BVDV疫苗的奶牛场，采集全血156 份，其中犊牛（0～6月龄）45 份，育成牛（7～18 月龄）58 份，成母牛53 份。室温静置自然凝固10～20 min，常规方法离心收集血清，编号，-20 ℃保存备检。

1.2 主要试剂和仪器

BVDV抗原ELISA检测试剂盒（特异性和敏感性均为99.9%），温州科淼生物科技有限公司；SPR-960酶标仪（450 nm波长滤光片），美国Bio-Rad公司；微量振荡器、恒温箱，上海普林斯顿公司。

1.3 检测方法

按照BVDV抗原ELISA检测试剂盒说明书操作，具体检测步骤为：（1）标准品稀释：在酶标包被板设置10 个标准孔，各取100 μL标准品分别加入第1、2孔，然后分别加入50 μL标准品稀释液，混匀，再从第1、2孔各取100 μL稀释后的标准品依次加入第3、4孔，并分别加入50 μL标准品稀释液，按照此方法依次类推，直到第9、10孔（最后第9、10孔各取50 μL弃掉）。（2）加样：在待测样品孔中先加40 μL样品稀释液，然后加入10 μL待测样品，混匀。同时设阴性对照孔、阳性对照孔各2 个，空白孔1 个。在阴性对照孔、阳性对照孔分别加入阴性对照、阳性对照50 μL。（3）温育：用封板膜封板后置37 ℃恒温箱温育30 min。（4）洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满配制后的洗涤液（20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释），静置后弃去液体，重复5 次，拍干。（5）加酶：除空白孔外，每孔加入酶标试剂50 μL。（6）温育、洗涤：分别同上述（3）（4）步骤。（7）显色：每孔加入显色剂A、B各50 μL，混匀，37 ℃避光显色10～30 min。（8）终止：每孔加终止液50 μL。（9）测定：以空白孔调零，加终止液后15 min内在波长450 nm处测量各孔的吸光度值（OD450）。（10）结果判定：当阳性对照孔OD450平均值≥1.00，阴性对照孔OD450平均值≤0.10时试验成立。临界值（CUT OFF）＝阴性对照孔OD450平均值＋0.15。待测样品OD450值＜CUT OFF者判为阴性；待测样品OD450值≥CUT OFF者判为阳性。

1.4 数据统计

采用Excel软件对试验数据统计分析。

2 结果

2.1 不同奶牛场的BVDV抗原检测

对5 家奶牛场156 份血清样品采用双抗夹心ELISA方法检测BVDV血清抗原，结果显示，BVDV抗原平均阳性率为4.49%（7/156）。5 家奶牛场BVDV抗原阳性率介于0～6.38%，其中，E奶牛场BVDV抗原阳性率最高，为6.38%，D奶牛场有效率最低，为0（表1）。

表1 不同奶牛场的BVDV抗原检测结果

2.2 不同年龄阶段奶牛的BVDV抗原检测

采用双抗夹心ELISA方法对不同年龄阶段奶牛血清样品进行BVDV抗原检测，结果显示，成母牛、犊牛、育成牛BVDV抗原阳性率分别为5.66%、4.44%、3.45%（表2）。

表2 不同年龄奶牛的BVDV抗原检测

3 讨论

ELISA检测原理是以体外抗原抗体特异性反应为基础，将酶的高效催化作用与抗原抗体特异性反应相结合的一种检测方法，主要有双抗夹心法、间接法、直接法和竞争法，被广泛应用于医学试验、生物制药、疫病流行病学调查等方面。本试验采用双抗体夹心法，具有灵敏度高、操作简单、检测速度快等特点，可用于大批量样本检测。

据报道，中国奶牛中合并BVDV流行率约为53.0%[7]。目前，我国奶牛场以规模化养殖为主，尽管精细化管理能够降低BVDV感染率，但由于地区间气候环境差异，饲养密度较大，饲养管理和疫病防控能力不强，部分地区奶牛场依然存在BVDV感染高风险。王丽屏等[6]对云南省4 个州部分奶牛场456 份血清样品进行BVDV抗原检测，抗原阳性率为0.53%。魏其等[8]调查发现，新疆部分地区牛养殖场BVDV阳性检出率为22.5%～62.5%，平均总阳性率为40.0%。何小丽等[9]报道，宁夏奶牛场BVDV抗原阳性率最高为5.0%，平均阳性率为1.48%。杨德新等[10]对河南省奶牛场BVD流行病学调查，5 486 份血清BVDV抗原阳性率为1.77%。结合本次调查成母牛、犊牛、育成牛BVDV抗原阳性情况分析，成母牛阳性率最高（5.66%），其次为犊牛（4.44%）、育成牛（3.45%），犊牛和育成牛差异不大，除与本次调查抽样数量少有关外，也与成母牛生长周期长，感染BVDV风险高，其抗原阳性率高于犊牛和育成牛，或者成母牛是在怀孕期间感染BVDV，导致该病毒在幼牛体内建立免疫耐受或者持续性感染有关[11]。

4 防控方法

BVD流行广泛，致病机理复杂，目前还缺乏有效的治疗药物。牛病毒性腹泻是一种以水平传播为主的疾病，由于病毒特性，一旦奶牛场发生BVD流行，很难彻底根除，淘汰携带病毒的动物成为防控该病的重要方法[12，13]。净化根除BVD，需要对奶牛场采取加强引种检疫、生物安全措施、免疫接种、定期检测等综合防控措施。

4.1 引种检疫

禁止从疫区引种。奶牛场在引种前需要对引进奶牛进行BVDV血清抗原和核酸检测，重点对持续性感染牛检疫，发现染疫奶牛采取隔离、扑杀等方法，防止BVD传播。

4.2 生物安全措施

严格落实环境消毒、卫生防疫制度，及时彻底清理分泌物和排泄物，保持圈舍通风、干燥、清洁。

4.3 定期检测

持续感染奶牛的淘汰是规模化奶牛场防控BVD最好的方式，也是规模化奶牛场最经济的做法。每年定期开展BVD血清学调查，全面检测BVDV血清抗体和抗原，了解流行情况。怀孕早期病毒穿过胎盘，可导致持续感染犊牛的出生。持续感染的奶牛通常比短暂或急性感染的奶牛能更有效地传播BVDV，因为能够在其一生中排出大量的病毒，并且被认为是BVDV的主要储存库[14]，因此要重点关注、及时筛查和清除持续感染BVDV奶牛。对检测的阳性奶牛隔离，30 d后再采血检测，淘汰仍为阳性者，并跟踪检测其母代奶牛。

4.4 免疫接种

疫苗有弱毒苗和灭活苗，育成牛在配种前再接种弱毒疫苗1 次，免疫期为1 年。若应用灭活疫苗，母牛配种前可免疫接种2 次，可有效预防该病。妊娠母牛在产前注射猪瘟兔化弱毒疫苗，15 份/头，也可以有效预防本病感染[15]。对BVDV抗原阴性奶牛及时进行BVDV疫苗免疫接种。

5 结论

本次流行病学调查初步摸清了榆林市奶牛场BVD流行特点。结果显示，在5 家奶牛场采集的156 份血清中检测到7 份BVDV抗原阳性，阳性率为4.49%，成年母牛阳性率较高，表明榆林市奶牛场BVD流行比较广泛。建议采取检疫检测、淘汰阳性牛和持续性感染牛，生物安全措施与免疫接种等多种防控方法。