液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中3种磺胺类药物残留的不确定度评定

◎ 梁健华，罗苑铭

（阳江市检测检验中心，广东 阳江 529500）

磺胺类药物属于化学合成抗菌剂，由于其价格低廉、抗菌效果好、使用方便[1]，一直被广泛用于治疗鸡传染性鼻炎、白冠病、球虫病、禽伤寒[2]，以降低畜禽的发病率，提高出栏率和商品率。磺胺类药物很容易通过动物身体吸收并蓄积在组织中，在畜禽类食品中造成残留。研究表明[3]，磺胺类药物容易损害人体的尿路系统，造成过敏反应，引起抗药性等。《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）[4]规定所有食品动物的肌肉（包括鸡肉）中的磺胺类药物残留应≤100 μg·kg-1，而近年来我国对禽肉磺胺类检测的频次也越来越多，对磺胺类药物残留的监管也越来越严格，这对检验检测实验室的能力也提出了更高的要求。

了解检测过程中测量不确定度的来源以及适当地对检测结果的不确定度进行评定，可以有针对性地对检测过程的重要影响因素进行控制，从而提高检测结果的准确度[5-6]。本研究基于农业部1077号公告—1—2008[7]以及CNAS—GL006：2019 化学分析中不确定度的评估指南[8]，采用LC-MS/MS法测定鸡肉中磺胺嘧啶（SD）、磺胺吡啶（SP）和磺胺甲氧哒嗪（SMP）等3种磺胺类药物残留的含量，并对检测结果的不确定度进行评定，分析了影响检测结果的关键因素，对提高结果的准确性具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

鸡肉采购于超市。

23种磺胺类药物混合标准溶液（100 μg·mL-1，包含SD、SP和SMP）和磺胺邻二甲氧嘧啶-D3（100 μg·mL-1）内标溶液，均购置于天津阿尔塔；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯。

LCMS-8045液质联用仪；JJ1000电子天平；100～1 000 μL可调移液器。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

准确吸取100 μg·mL-1的磺胺类药物混合标准溶液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容配制成浓度为1.0 μg·mL-1的标准储备液。逐步将100 μg·mL-1的内标溶液用甲醇稀释配制为0.1 μg·mL-1的内标工作液。使用移液器分别准确吸取0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL和1.00 mL标准储备液（1.0 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中，并各加入0.1 mL内标工作液，用甲醇定容，分别配制成0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和100 ng·mL-1的标准曲线工作溶液。

1.2.2 试验前处理

参照农业部1077号公告—1—2008进行鸡肉样品前处理过程。取空白捣碎的鸡肉样品，添加10.0 μg·kg-1磺胺标准物质，作为不确定度评定的试验样品。称取5.00 g鸡肉样品于离心管中，加入0.1 mL浓度为0.1 μg·mL-1的内标工作液，涡旋混合30 s。往混合液中加入10 g Na2SO4，混合后，加入20 mL酸化乙腈（甲酸∶乙腈=1∶99，V∶V），旋涡1 min，超声20 min。提取液于4 000 r·min-1转速下离心5 min，取上清液于梨形瓶中。加入20 mL酸化乙腈溶解残渣，重复上述操作，合并2次提取液，在40 ℃水浴锅中旋转蒸发至干。加入1.00 mL甲醇溶液（甲醇∶水=20∶80，V∶V）溶解残留物，再加入2.0 mL正己烷，混合30 s，转入离心管中，4 000 r·min-1离心5 min，取下层清液过0.22 µm微孔滤膜，供LC–MS/MS测定。

1.2.3 LC–MS/MS条件

（1）液相色谱条件。ACE Excel 2 SuperC18色谱柱（2 μm，100 mm×2.1 mm）；流动相：0.1%甲酸（含2.0 mmol·L-1乙酸铵）（A）-乙腈（B）。液相色谱梯度洗脱程序：0～0.01 min，3%B；0.01～7.00 min，50%B；7.0～7.1 min，3%B。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾电离ESI（+）；扫描模式：多反应监测模式。

1.2.4 数学模型

鸡肉中SD、SP和SMP的含量计算公式为

式中：X为鸡肉中各磺胺类药物残留含量，μg·kg-1；C1为样液中各磺胺类药物残留浓度，ng·mL-1；C0为空白样液中各磺胺类药物残留浓度，ng·mL-1；V为最终定容体积，mL；m为鸡肉的称样量，g。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源的识别和分析

根据试验方法和数学模型，磺胺类药物残留检测过程中主要受到提取、曲线校准、回收率和仪器检测等4个方面的影响，如图1所示。①提取过程，主要包括样品称量、提取除杂方法和样液定容等测量不确定度分量，而提取除杂方法的测量不确定度分量纳入回收率和重复性中。②曲线校准，其不确定度主要包括标准物质、标准工作溶液配制和标准工作曲线拟合等不确定度分量。③回收率，可使用回收率的重复性标准偏差表示其不确定度。④仪器检测，样品检测的测量不确定度主要由重复性和仪器的响应组成，而重复性包括了仪器的响应，因此只需要评定测量的重复性。由此可见，磺胺类残留物检测中引入的不确定度包括样品称量urel(m)、样液定容urel(V)、标准工作溶液配制urel(cc)、标准工作曲线拟合urel(C)、回收率urel(R)和样品重复性测试urel(re)。

图1 测量不确定度因果关系图

2.2 不确定度分量的量化

2.2.1 样品称量引入的相对标准不确定度urel(m)

样品称量引入的不确定度主要表现为天平的校准和重复性。

（1）天平的校准引入的不确定度u(m1)。天平检定证书给出的天平示值误差的扩展不确定度为U=0.03 g，k=2。每个样品均使用了2次天平进行称量，而称量过程是独立的，则由天平校准引入的不确定度为

（2）天平重复性引入的不确定度u(m2)。天平检定证书给出的天平重复性误差为0.01 g，对于每个样品，均使用了2次天平称量，按与2.2.1（1）相同的方法计算，则由天平重复性引入的不确定度为u(m2)=0.007 1 g。

2.2.2 样液定容引入的相对标准不确定度urel(V)

定容采用1 000 μL移液器吸取甲醇溶液（甲醇∶水=20∶80，V∶V），引入的测量不确定度主要由移液器校准给出的测量不确定度、示值的允许误差限和定容温度的影响组成。

（1）移液器校准引入的不确定度u(V1)。移液器校准证书给出的扩展不确定度为U=0.007 μL，k=2，则由校准引入的标准不确定度为

（2）移液器示值误差引入的不确定度u(V2)。移液器示值允许误差为1.0 μL，按矩形分布，则其标准不确定度为

（3）使用移液器由温度变化引入的不确定度u(V3)。移液器校准时的温度为20 ℃，实验时的温度约为26 ℃，已知水的膨胀系数为0.000 21/℃，则移液器产生的体积变化为10×6×0.000 21=0.012 6 μL，按矩形分布，则由温度变化引入的标准不确定度为

则使用移液器定容引入的相对标准不确定度urel(V)为

2.2.3 标准工作溶液配制引入的不确定度urel(cc)

（1）标准物质引入的不确定度urel(S)。由标准物质证书得到SD、SP和SMP的质量浓度分别为100.0 μg·mL-1、100.1 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1，相对扩展不确定度Urel均为0.05（k=2），则其相对标准不确定度为

（2）标准储备液配制引入的不确定度urel(ca)。配制1.0 μg·mL-1标准储备液使用了1 000 μL移液器和10 mL容量瓶，容量瓶定容和移液器吸液引入的测量不确定度均表现为校准给出的测量不确定度、示值的允许误差限和定容温度的影响，计算过程同2.2.2。

①使用量瓶引入的不确定度urel(c)。容量瓶校准证书给出的扩展不确定度为U=0.006 mL，k=2，则由校准引入的标准不确定度为根据JJG 196—2006[9]，容量为10 mL的A级单标线容量瓶的最大示值允许误差为0.020 mL，按矩形分布，则由示值允许误差引入的标准不确定度为校准容量瓶时的温度为20 ℃，而检测时的温度约为26 ℃，已知甲醇的膨胀系数为0.001 18/℃，则容量瓶产生的体积变化为10×6×0.001 18=0.070 8 mL，按矩形分布，则由温度变化引入的标准不确定度为使用容量瓶引入的相对标准不确定度为

②使用移液器引入的不确定度urel(a)。根据2.2.2（1）和（2），1 000 μL移液器由校准、示值允许误差引入的标准不确定度分别为0.003 5 μL和0.58 μL。吸取甲醇由温度变化引入的标准不确定度为1 000×6×0.001 18/则使用移液器引入的相对标准不确定度为

则标准储备液配制引入的相对标准不确定度urel(ca)为

（3）标准曲线工作溶液配制产生的不确定度urel(pz)。配制标准曲线工作溶液过程使用了4次1 000 μL移液器和4次10 mL容量瓶，因此使用容量瓶和移液器构成了配制标准曲线工作溶液不确定来源的主要因素。①使用容量瓶引入的不确定度urel(c4)。使用容量瓶引入的不确定度的计算同2.2.3（2）①，由于使用4个容量为10 mL的容量瓶是相互独立的，所以其合成相对标准不确定度为②使用移液器引入的不确定度urel(bz)。标准曲线工作溶液配制过程使用了4次可调移液器，其引入的测量不确定度计算过程同2.2.3（2）②，结果见表1。

表1 使用移液器产生的测量不确定度分量表

则标准曲线工作溶液配制引入的相对标准不确定度urel(pz)为

则标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度urel(cc)为

2.2.4 标准工作曲线拟合引入的不确定度urel(C)

取5个浓度水平点系列标准使用溶液各测定1次，以标准溶液浓度与内标浓度的比值对标准溶液色谱峰面积与内标峰面积比值作线性拟合得到回归方程y=b0+b1C，测定结果见表2。由表2可知，SD、SP和SMP的线性回归方程以及相关系数r2分别为y=0.067 2+0.043 9CSD（r2=0.999 2），y=0.125 9+0.041 4CSP（r2=0.995 5）和y=0.235 7+0.111 4CSMP（r2=0.998 2）。

表2 3种磺胺类药物残留标准工作曲线测定结果表

本实验对提取液进行了6次测定，由线性回归方程求得各次测定值，计算3种磺胺类药物残留的平均质量浓度C，其中SD、SP和SMP的平均质量浓度C分别为49.02 ng·mL-1、48.93 ng·mL-1和48.71 ng·mL-1，根据CNAS—GL006：2019，其相对标准不确定度urel(C)为

式中：SR为标准溶液峰面积比值的标准偏差，C为各磺胺类药物残留的平均质量浓度，ng·mL-1；b1为线性回归方程的斜率；P为样品测定液重复测定的次数，P=6；n为标准工作溶液测定的次数，n=5；为标准系列工作溶液的平均质量浓度，Ci为标准工作溶液的质量浓度，ng·mL-1。

经计算得到，SD、SP和SMP的检测过程中由标准工作曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(C)分别为0.017、0.040和0.026。

2.2.5 回收率引入的不确定度urel(R)

在空白鸡肉样品中加入10 μg·kg-1的磺胺混合标准溶液，在再现性的条件下，测定6次，并计算回收率，回收率的测量不确定度urel(R)采用其重复性标准偏差表示，结果如表3所示。

表3 回收率测定结果表

2.2.6 样品重复性测试引入的不确定度urel(re)

采用空白鸡肉样品加入10 ng·kg-1的磺胺类药物混合标准溶液，在重复性的条件下，测定6次，得到6次测定结果，并采用测定结果的标准偏差表示重复性的测量不确定度，样品重复性测试引入的相对标准不确定度urel(re)的结果如表4所示。

表4 重复测定的结果表

2.3 相对标准不确定度的合成及扩展

2.3.1 合成相对标准不确定度urel(X)

对样品称量、样液定容、标准工作溶液配制、标准工作曲线拟合、回收率和重复性等各相对不确定度分量进行分析，合成相对标准不确定度为

经计算得SD、SP和SMP检测过程中的合成相对标准不确定度urel(X)分别为0.071 5、0.080 1和0.075 0。

2.3.2 相对扩展不确定度Urel

取置信概率95%，k=2，得到LC–MS/MS法测定鸡肉中SD、SP和SMP的相对扩展不确定度Urel分别为0.143、0.160和0.150。

2.3.3 扩展不确定度U

根据表4，当鸡肉中SD、SP和SMP的残留量分别为9.78 μg·kg-1、9.67 μg·kg-1和9.54 μg·kg-1，按照公式U=Urel×X，则SD、SP和SMP检测过程中扩展不确定度分别为1.40 μg·kg-1、1.55 μg·kg-1和1.43 μg·kg-1。

2.3.4 结果表示

通过LC–MS/MS法测定鸡肉中SD、SP和SMP残留量的测定结果分别为（9.78±1.40） μg·kg-1、（9.67±1.55） μg·kg-1和（9.54±1.43） μg·kg-1。

3 结论

本研究采用LC–MS/MS法测定鸡肉中SD、SP和SMP含量，并对试验过程中样品称量、样液定容、标准工作溶液配制、标准工作曲线拟合、回收率和重复性等因素产生的不确定度进行分析评定。经分析发现，标准工作溶液配制和标准工作曲线拟合是影响实验结果准确性的主要因素。为了提高检测结果的准确性，在试验过程中应使用校准后的容量瓶和移液器，并适当增加标准工作曲线的浓度点及测定次数。