低磷胁迫下大豆根系分泌物对土壤中难溶性磷的影响

杨松花,石贵阳,王晶琴,陈 竹

(贵州大学 农学院,贵州 贵阳 550025)

大豆[Glycinemax(L.) Merr.]含有丰富的优质蛋白、不饱和脂肪酸和钙,是膳食中优质蛋白质的重要来源,营养价值高,栽培广泛,是喜磷作物之一。无机磷含量在大部分土壤中占有主导地位,其中绝大部分以吸附态和固体矿物态存在,导致植物难以吸收利用。土壤全磷含量不低,但可被大豆利用的有效磷含量并不高。有研究表明,在酸性和石灰性土壤中,缺磷更可能成为大豆高产的重要限制因素之一[1]。增加磷肥的施入量是缓解土壤磷与农作物生长矛盾的传统方法,但磷易被土壤固定,施入土壤的磷肥在酸性环境土壤中主要以难溶性铁磷(Fe-P)、铝磷(Al-P)和闭蓄态磷(O-P)形式被固定,在碱性土壤中主要以钙磷(Ca-P)形式被固定,降低磷肥的利用率,不能有效解决作物缺磷问题,反而增加了农业成本。另一方面,磷肥被淋洗进入水体后,易造成环境污染,加重环境污染负担[2]。近年来,为解决作物缺磷的关键问题,国内外研究纷纷致力于挖掘作物自身对磷的利用潜力和提高土壤中难溶态磷的生物有效性。

根系分泌物中的有机酸、磷酸酶等对活化土壤中的难溶性磷具有重要作用[3]。研究发现,白羽扇豆[4-5]、木豆[6-7]、菜豆[8-9]、紫云英[10]和蚕豆[11]等豆科植物的根系分泌物能提高土壤磷素的有效性,进而提高作物对难溶性磷酸盐的活化。这主要是因为缺磷胁迫能增加豆科植物根系分泌物中有机酸的分泌量,显著提高对难溶性磷的活化效果。杨利宁等[12]的研究发现,缺磷条件下苜蓿根系分泌物对土壤中难溶性磷的活化效果高于供磷条件下。降低根际pH值,促进难溶性磷的溶解,提高磷的生物有效性,是有机酸活化土壤难溶性磷的机制之一;有机酸通过螯合Fe、Al、Ca等,促进难溶性磷酸盐的溶解,释放出磷酸根离子,同时,也可以通过竞争土壤表面吸附位点,来降低土壤对磷酸根的吸附。研究发现,外加低分子量的有机酸能促进大豆植株磷的吸收积累,活化土壤中难溶性无机磷[13]。研究大豆根系分泌物对土壤中难溶性磷的活化作用,对如何改善土壤中磷素利用率,增加大豆吸磷量,充分挖掘磷素这一养分库以提高大豆产量和品质,对促进我国农业的可持续发展具有重要意义。基于此,本试验选择10种大豆品种,在低磷胁迫条件下收集根系分泌物,测定有机酸组分及分泌量,并用分泌物进行土壤培养,旨在探明大豆根系分泌物对土壤中难溶性磷的活化效果,为今后筛选磷高效大豆品种、提高土壤中难溶性磷利用率的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试大豆品种为铁豆40号(Td)、川豆14(Cd)、黔豆11号(Qd11)、铁丰31号(Tf)、滇86-4(Dd)、矮选(Ax)、晋豆23号(Jd23)、冀豆12号(Jd12)、汾豆62号(Fd)和黔豆7号(Qd7),供试材料均由课题组老师提供。供试大豆品种的特征如下：铁豆40号,有限结荚习性,百粒重23.8 g,属中熟品种, 生育期132 d左右;川豆14,直立生长,株形收敛,有限结荚习性,百粒重24 g,春播大豆,生育期110 d左右;黔豆11号,有限结荚习性,百粒重18～22 g,春播大豆,生育期116.3 d;铁丰31号,株形收敛,有限结荚习性,百粒重18～22 g,属中晚熟春大豆品种,生育期133 d左右;滇86-4,直立有限结荚习性,百粒重19.1 g,中早熟品种,生育期122 d左右;矮选,株形开张,百粒重13～15 g,生育期110 d左右;晋豆23号,株形收敛,无限结荚习性,百粒重21.0～23.5 g,春大豆,生育期128～133 d左右;冀豆12号,株形呈塔形,有限结荚习性,百粒重22～24 g,黄淮夏中早熟品种,生育期100 d左右;汾豆62号,植株直立,株形开张,无限结荚习性,百粒重17 g,属晚熟品种,生育期139 d;黔豆7号,株形收敛,有限结荚习性,百粒重15.9 g,南方春、夏大豆,生育期平均116 d。

供试有机酸标准品为乙酸、乳酸、延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、草酸、酒石酸。这8种有机酸在植物根系分泌物中占有重要比例,其中柠檬酸、苹果酸和草酸等的研究报道较多。基于此,本研究选择测定这8种有机酸,探究低磷胁迫下其分泌量的变化。

1.2 试验方法

试验设正常供磷的对照处理(0.5 mmol·L-1KH2PO4,NP)和低磷胁迫处理(0.02 mmol·L-1KH2PO4,LP),每个处理重复6次。选取大小均匀的大豆种子,1%次氯酸钠浸泡5 min后用无菌水洗净,避光发芽。幼苗发芽后先移入灭菌基质中栽培,待子叶展开后,移入光照培养箱,营养液水培,每小时向营养液通气15 min,每3 d用0.1 mol·L-1的KOH 或HCl调节营养液pH值至5.9～6.0。供试营养液配方如下：硝酸钾1.5 mmol·L-1、硝酸钙1.2 mmol·L-1、硝酸铵0.4 mmol·L-1、硫酸钾0.3 mmol·L-1、硫酸镁0.5 mmol·L-1、氯化镁0.025 mmol·L-1、硫酸锰0.001 5 mmol·L-1、硫酸铵0.3 mmol·L-1、硫酸锌0.001 5 mmol·L-1、硫酸铜0.000 5 mmol·L-1、钼酸铵0.000 15 mmol·L-1、硼酸钠0.002 5 mmol·L-1、氯化钴0.000 1 mmol·L-1、EDTA-铁盐0.04 mmol·L-1、磷酸二氢钾0.5 mmol·L-1。缺素处理12 d后收获植株,测定根系分泌物中的有机酸含量,并将分泌物倒入土壤中进行培养。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 根系分泌物的收集

用去离子水将根系冲洗干净后,以250 mL的CaCl2(0.5 mmol·L-1)溶液作为收集液,并向收集液中加入3滴百里酚(20 g·L-1)作为微生物抑制剂,将根系浸入收集液中,根部避光培养5 h后,取出根系,所得到的溶液即为根系分泌物收集液,每个处理重复6次,3个用于测定其组分和含量,另外3个用于培养土壤试验,用滤纸过滤后移入-20 ℃环境中保存备用。

1.3.2 有机酸的测定

使用冷冻干燥机将根系分泌物收集液浓缩至10 mL,过0.22 μm滤膜后使用Agilent LC1260型号高效液相色谱仪测定有机酸浓度,并计算有机酸分泌量。

标准曲线的绘制：分别准确称取色谱纯的标准样品草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、延胡索酸、琥珀酸,用超纯水配成浓度为200 mg·L-1的标准样品储备液,过0.22 μm滤膜后,保存于4 ℃冰箱中备用。将8个酸的储备液按0.5∶2.5∶5∶10∶5∶5∶0.05∶10的比例配制成混酸标样,然后再分别稀释0、2、4、6、8、10倍,以配置标准曲线。

具体色谱条件如下：色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250mm 5-Micron);流动相为0.01 mol·L-1KH2PO4(pH值1.70)和CH3OH(体积比为97∶3),检测波长为210 nm,流速为0.5 mL·min-1,柱温25 ℃,进样量为10 μL,采用外标法定量。

1.3.3 土壤培养

准确称取过100目筛的风干土10 g于小烧杯中,分别加入浓缩后的根系分泌物 10 mL,以加入10 mL 去离子水为对照。每个处理重复3次。于恒温培养箱(25 ℃)中培养 10 d。

1.3.4 难溶性磷的测定

用0.5 mol·L-1NH4F提取Al-P;用0.1 mol·L-1NaOH提取Fe-P;用0.3 mol·L-1柠檬酸钠和连二亚硫酸钠混合溶液提取O-P;用0.25 mol·L-1H2SO4提取Ca-P。利用不同化学浸提剂将土壤中的无机磷酸盐逐级分离后,用钼锑抗比色法测定,参考酸性土壤无机磷形态的分级测定方法[14]。供试土壤的基本理化性质如下：pH值为5.35,有机质含量为16.08 mg·kg-1,有效磷含量为4.1 mg·kg-1,Al-P含量为224 mg·kg-1,Fe-P含量为133.91 mg·kg-1,O-P含量为266.71 mg·kg-1,Ca-P含量为17.89 mg·kg-1。活化率为培养前后磷含量差值与培养前磷含量的比值。

1.4 数据处理

采用WPS表格软件整理数据,用SPSS 22.0软件进行统计分析,用Origin 2018软件制图。

2 结果与分析

2.1 低磷胁迫对大豆根系分泌物中有机酸含量的影响

对根系分泌物有机酸含量进行方差分析(表1)发现,不同大豆品种、磷水平以及品种与磷水平之间的交互效应对有机酸的含量均有影响,不同品种之间的有机酸含量均达到极显著,磷水平对乙酸、乳酸、延胡索酸、琥珀酸、苹果酸和总酸含量的影响达到极显著,品种与磷水平间的交互效应对各有机酸组分和总酸含量的影响均达到极显著。上述结果表明,低磷胁迫影响有机酸的分泌量。

表1 根系分泌有机酸含量的双因素分析

低磷胁迫下不同品种有总机酸分泌量如图1所示,与正常供磷相比,Qd11、Ax、Jd12和Fd的总有机酸分泌量在低磷胁迫下增加,达到极显著差异,Jd23达到显著差异,其余品种总有机酸分泌量未增加。低磷胁迫条件下,各品种的总有机酸分泌量表现为Cd>Jd23>Qd11>Ax>Jd12>Dd>Td>Fd>Tf>Qd7,其中Cd、Jd23、Qd11的分泌量分别为32.996、22.893、17.896 mg·h-1·g-1。

2.2 低磷胁迫不同大豆品种根系分泌物中有机酸不同组分分泌量的影响

不同磷水平处理的大豆根系分泌物中有机酸组分测定结果见表2,不同大豆品种无论在正常磷或是低磷条件下,均检测到乙酸、乳酸、延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、草酸和酒石酸共8种有机酸。低磷胁迫影响了有机酸的含量,不同大豆品种根系分泌的有机酸组分在数量上存在差异,Td、Cd、Qd11、Tf、Dd和Qd7以分泌草酸为主,Ax、Jd23、Jd12和Fd以分泌酒石酸为主。低磷胁迫下,Qd11的柠檬酸、苹果酸和草酸的分泌量显著增加,是正常磷的3.1、2.4和5.3倍,Dd的琥珀酸和草酸的分泌量是正常磷的3.4和2.3倍,Ax的苹果酸和酒石酸的分泌量是正常磷的3.2和5.8倍,Jd12的琥珀酸和酒石酸的分泌量是正常磷的2.2和2.5倍。琥珀酸(除了Qd11)和苹果酸(除了Td、Cd和Dd)是大多数品种缺磷处理下有增多趋势的有机酸,从不同大豆品种的琥珀酸分泌量来看,在低磷条件下,Dd的分泌量最高,为3.030 mg·h-1·g-1,Fd的分泌量低,为0.638 mg·h-1·g-1。从不同基因型大豆苹果酸分泌量来看,Qd7的分泌量最高,为1.047 mg·h-1·g-1,其他各品种分泌的量较少,分泌量在0.082～0.510 mg·h-1·g-1。结果表明,不同大豆品种分泌的主要有机酸不同。

表2 不同磷水平下大豆根系有机酸分泌量

2.3 根系分泌物对难溶性无机磷的活化作用

2.3.1 不同大豆品种根系分泌物对土壤Al-P的活化效果

各大豆品种根系分泌物对土壤中难溶性磷有不同程度的活化作用(图2-A),磷水平对Al-P活化率的影响不显著,但品种以及品种与磷水平的交互作用对Al-P的活化率的影响达到极显著水平。蒸馏水(CK)的活化率为11.4%,无论是正常磷还是低磷胁迫下,各大豆品种根系分泌物对土壤难溶性Al-P的活化效果均高于CK,其中Td、Cd、Jd23和Fd这4个品种在低磷处理下收集的根系分泌物对Al-P的活化效果高于正常供磷处理;低磷处理下,各大豆品种的活化效果表现为Jd23>Jd12>Cd>Qd11>Td>Tf>Ax>Fd>Dd>Qd7,Jd23根系分泌物的活化率达32.39%;活化效果最弱的是Qd7,活化率为12.55%。上述结果说明,大豆根系分泌物对土壤中Al-P有活化效果。

图2 各大豆品种根系分泌物对Al-P和Fe-P的活化Fig.2 Activation of Al-P and Fe-P by root exudates of soybean varieties

2.3.2 不同大豆品种根系分泌物对土壤Fe-P的活化效果

不同大豆品种根系分泌物对Fe-P的活化效果见图2-B,品种和磷水平及其交互作用对Fe-P的活化率的影响均达到极显著水平。CK的活化率为13.9%,大豆根系分泌物对土壤难溶性Fe-P活化的同时,也存在吸附作用,各品种的活化效果均不如CK;不同品种间根系分泌物对Fe-P的活化效果存在显著性差异,在低磷胁迫下,除了Cd、Tf和Dd,其他品种分泌物的活化效果提高,其中Qd7的活化效果最好,活化率为12.60%,其次是Qd11,活化率为11.81%。

2.3.3 不同大豆品种根系分泌物对土壤O-P的活化效果

如图3-A所示,品种和磷水平及其交互作用对O-P的活化率的影响均达到极显著水平。CK对土壤中O-P的活化率为11.2%,除低磷处理下Cd的活化效果低于CK外,其他处理的各品种根系分泌物对O-P的活化效果均高于CK。相比正常磷处理,在低磷处理下,除了Cd和Dd外,其他品种的分泌物对难溶性磷的活化率均有提高,说明低磷能促进大豆根系分泌物对土壤O-P的活化作用,其中,Qd11表现最好,极显著高于正常磷处理,活化率为32.69%,其次是汾豆62号,活化率为28.18%,低磷胁迫下,各大豆品种活化效果表现为Qd11>Fd>Qd7>Tf>Jd23>Dd>Ax>Jd12>Td>Cd。

图3 各大豆品种根系分泌物对O-P和Ca-P的活化Fig.3 Activation of O-P and Ca-P by root exudates of soybean genotypes

2.3.4 不同大豆品种根系分泌物对土壤Ca-P的活化效果

不同品种根系分泌物对Ca-P的活化效果见图3-B,品种和磷水平及其交互作用对Ca-P的活化率的影响均达到极显著水平。CK的活化率为19.42%,除了Cd和正常磷处理下的Jd23,其余各大豆品种的分泌物对Ca-P的活化率均高于CK。低磷处理下,除了Tf和Ax,其他大豆品种分泌物的活化率均高于正常磷处理,说明低磷能促进大豆根系分泌物对土壤Ca-P的活化作用。总的来说,活化效果表现为Qd11>Fd>Dd>Ax>Qd7>Jd12>Jd23>Td>Tf>Cd14,Qd11的活化率为41.73%。

比较不同品种对于4种难溶性磷的活化效果差异,整体上Ca-P的活化效果最佳,其次是O-P和Al-P,最弱的是Fe-P;大部分品种在低磷处理下的根系分泌物对土壤难溶性无机磷的活化效果要高于正常供磷处理,说明低磷胁迫下大豆根系的分泌物对难溶性磷有一定的活化作用。不同品种大豆对不同难溶性无机磷的活化效果不同,整体来说,Qd11和Qd7的根系分泌物对4种难溶性磷的活化效果较好。

2.3.5 不同大豆品种根系分泌物对土壤总无机磷的活化效果

不同大豆品种根系分泌物对无机磷总含量的活化效果见图4,无论在正常磷还是低磷处理,添加大豆分泌物对土壤中无机磷总量的活化有促进作用,均减少了无机磷在土壤中的含量。相比正常磷处理,在低磷胁迫下,Td、Qd11、Jd23、Fd和Qd7的根系分泌物加入到土壤中后,显著减少了无机磷含量,但Cd、Tf和Dd的无机磷含量增加,而Ax和Jd12的无机磷总量在培养前后无显著差异。

图4 各大豆根系分泌物培养前后总无机磷的变化量Fig.4 Changes of total inorganic phosphorus in soybean root exudates before and after culture

2.4 有机酸对土壤中难溶性磷的影响

对8种有机酸的分泌量和4种难溶性磷的活化率进行相关性分析发现,草酸的分泌量与Ca-P的溶解量有相关性,P值为0.091,酒石酸的分泌量与Al-P的溶解量有相关性,P值为0.098,苹果酸的分泌量与Fe-P的溶解量达到显著相关,P值为0.012,琥珀酸分泌量与钙磷的溶解量呈显著正相关,P值为0.023。

3 结论与讨论

磷在土壤中的移动性极弱,缺磷是植物生长的重要限制因子,为了获取磷,磷高效植物进化出了一系列机制。其中,增加低分子量的有机酸,如草酸、柠檬酸、苹果酸和酒石酸的分泌,对改善植物磷营养具有十分重要的作用。有机酸可以与磷酸铁、磷酸铝、磷酸钙等难溶性无机磷发生络合反应,生成移动性强的磷酸二氢根离子,促进植物对难溶性磷的吸收。分泌能力强的植物,可以将25%的光合同化产物以根系分泌物的形式排放到根际,改善根际环境。本研究表明：无论是否受到低磷胁迫,所有大豆品种都会向根系外分泌有机酸,占其总生物量的2%～15%(图1)。低磷胁迫下,Qd11、Ax、Jd23、Jd12和Fd的有机酸分泌量显著增加,这表明分泌有机酸是这些品种的重要耐低磷机制。除了分泌有机酸外,植物还可以通过增加根冠比,与菌根共生等机制改善磷营养状况。在本研究中,与正常供磷处理相比,Cd、Tf、Dd在低磷胁迫下有机酸分泌量没有显著性差异,而Td和Qd的有机酸分泌率甚至显著降低,表明这些品种可能采取其他策略。例如,在土壤容重更低的环境下,植物可能通过扩大根系体积来获取磷,而菌根真菌丰富的环境下,与菌根共生更有利于植物对磷的吸收。

在缺磷胁迫下,植物通过增加低分子量有机酸的分泌,来促进自身对土壤中难溶性含磷化合物的利用,改善其体内磷营养状况[15]。本研究发现,低磷胁迫对大豆有机酸的分泌有影响,这与紫云英[10]、菜豆[8]、大豆[16-17]等豆科植物的研究结果一致。Qd11在低磷胁迫下,柠檬酸、苹果酸和草酸的分泌率显著增加,分别是正常磷的3.1、2.4和5.3倍。这与张振海等[18]的研究结果一样,他指出耐低磷基因型大豆相比敏感型分泌出更多的有机酸,且差异显著。王美丽等[19]的研究也发现,大豆在磷胁迫时草酸的分泌量高于供磷处理。本研究结果显示,低磷胁迫下,Ax、Jd23、Jd12和Fd主要增加酒石酸的分泌。田中民等[20]的研究结果表明,缺磷条件下白羽扇豆根系分泌的有机酸为苹果酸、柠檬酸和反丁烯二酸。束良佐[21]指出,白羽扇豆在低磷条件下形成的排根能大量释放柠檬酸,以活化土壤中难溶性的磷。秦丽凤[22]的结果显示,低磷胁迫下,木豆根系分泌苹果酸。由此可见,不同作物或者不同品种根分泌的优势有机酸不同。

有机酸向根际的释放受有机酸阴离子蛋白的调控,缺磷胁迫下根系有机酸的释放与植物体内有机酸代谢酶有关,如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、柠檬酸合成酶的活性升高,有机酸分泌主要靠质膜上的转运蛋白,如ALMT蛋白负责转运苹果酸,MATE蛋白负责柠檬酸阴离子的分泌[23]。李娇娇等[24]对磷高效大豆的研究表明,低磷胁迫显著增加三羧酸循环中间产物苹果酸的分泌,并克隆了苹果酸转运酶GmALMT基因,暗示低磷可能通过调控苹果酸转运子基因的表达或其蛋白活性来促进苹果酸的分泌。草酸在根系中的合成前体可能是柠檬酸或草酰乙酸,但目前没有大豆乙醇酸氧化酶或草酰乙酸裂解酶的相关研究。下一步研究中可以结合大豆全基因组测序结果,探索不同大豆品种有机酸分泌对低磷胁迫响应的分子机制。

不同有机酸组分对土壤难溶性磷的活化效果有较大差异。我们的研究表明,草酸与Ca-P的活化量呈正相关关系(P=0.091,r=0.423),这与Strom等[32]和刘慧等[33]的研究一致。草酸根能与Ca2+形成草酸钙沉淀,促使Ca-P的释放。苹果酸与Fe-P(P=0.012,r=0.581)活化量呈正相关关系,分泌到土壤中的这些有机酸可以通过氢离子的酸效应和阴离子的络合效应来促进磷的活化,且随着有机酸浓度增大,其氢离子的酸效应和阴离子的络合效应也增强。但总有机酸与总无机磷活化量之间相关性较差,出现较多与总体趋势不一致的异常品种。例如Tf31和Qd7在低磷处理中总有机酸分泌量分别为2.67 mg·h-1和2.79 mg·h-1,但他们对难溶无机磷的活化量达105.02 mg·kg-1和111.80 mg·kg-1,而Cd14在低磷处理中总有机酸分泌量高,但它对难溶无机磷的活化量仅为61.77 mg·kg-1。这可能有两方面的原因：一方面,大豆根系能合成磷高效转运蛋白GmPHT1,GmPHT1在吸收磷的过程中,会与H+-ATPase协同,促使后者向根系中分泌H+,降低土壤pH值,促进难溶磷的溶解;另一方面,Tf31和Qd7可能合成了某些未知的对难溶磷有很强活化效果的有机酸。

本研究结果显示,贵州本地育成品种Qd11和Qd7受低磷胁迫后,其根系分泌物对土壤难溶性无机磷的活化效果显著高于正常供磷处理。本实验所用的土壤为极端贫瘠的贵州黄壤,其有效磷仅为4.1 mg·kg-1,说明本地品种对黄壤具有更强的适应性。